圖1：免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化圖

 

Boosting the Immune System–

Steps to Take for Successful Substrate Delivery

嵌合抗原受體表達(dá)細(xì)胞的產(chǎn)生和基于CRISPR/Cas9的基因組編輯等新技術(shù)的建立，為改善或增強(qiáng)免疫應(yīng)答提供了簡便易行的方案。然而，將底物輸送到我們的目的細(xì)胞中是必不可少的-不僅要注重高轉(zhuǎn)染效率，而且要注重細(xì)胞活性、功能性的保存以及患者的健康和安全。此外，傳遞方法在底物方面應(yīng)該是靈活的，因為編輯細(xì)胞基因組的研究人員不僅依賴于質(zhì)粒DNA的成功轉(zhuǎn)染，還依賴于RNA和/或蛋白質(zhì)的成功轉(zhuǎn)染^[1]。

到目前為止，原代免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染是具有挑戰(zhàn)性的。特別是大家感興趣的細(xì)胞類型，如T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞，用經(jīng)典的基于試劑的方法很難轉(zhuǎn)染^[2]。使用轉(zhuǎn)染試劑的主要問題是轉(zhuǎn)染效率低、細(xì)胞毒性和免疫原性。后者在免疫治療方面是不利的，因為細(xì)胞應(yīng)該維持它們在免疫系統(tǒng)中的功能，而不是被轉(zhuǎn)染方式預(yù)先激活。

 

實現(xiàn)合理轉(zhuǎn)染效率的替代方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，但病毒生產(chǎn)耗時且成本高，另一種方案是改進(jìn)的電穿孔技術(shù)，如Nucleofector^TM技術(shù)，作為一種物理的方法，它只需要很低的生物安全預(yù)防措施(表1)。

 

表1：不同底物輸送給原代免疫細(xì)胞的優(yōu)缺點綜述

 

實現(xiàn)免疫細(xì)胞

高效基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的三個步驟

 

步驟1-選擇合適的轉(zhuǎn)染方法

通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以將感興趣的基因整合到宿主基因組中。最常用的是慢病毒載體，慢病毒載體尚不能將目的基因插入到特定位點而是隨機(jī)插入。

 

一種將底物遞送到人體免疫細(xì)胞的便捷技術(shù)是Nucleofector^TM技術(shù)，這是一種改進(jìn)的電穿孔技術(shù)。專用的Nucleofector^TM解決方案與針對特定細(xì)胞類型優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)相結(jié)合，使研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和良好的存活率。底物直接輸送到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。最小化的免疫原性保留了免疫細(xì)胞的功能(圖2)。

 

圖2：Nucleofection后的細(xì)胞功能。條形圖顯示了小鼠樹突狀細(xì)胞、人類巨噬細(xì)胞和人類T細(xì)胞在Nucleofection后的相對功能(樣本)。功能以與未轉(zhuǎn)染對照(對照)相關(guān)的百分比表示。用小鼠樹突狀細(xì)胞的IL-6特異性ELISA、人巨噬細(xì)胞的TNF-a特異性ELISA、刺激的人T細(xì)胞的IFN-g特異性ELISA和CD25特異性抗體(靜息狀態(tài)和刺激狀態(tài))流式細(xì)胞儀進(jìn)行功能分析。實驗是在標(biāo)準(zhǔn)的Nucleofector^TM設(shè)備(小鼠樹突狀細(xì)胞)或96孔Shuttle^TM系統(tǒng)(人巨噬細(xì)胞和人T細(xì)胞)上進(jìn)行的。^[3]

Nucleofector^TM技術(shù)不僅保證了效率和可行性。考慮到表達(dá)CAR的T細(xì)胞^[4]和NK細(xì)胞^[5]以及基因組編輯^[6]，不同底物的共轉(zhuǎn)染也是可以簡單的實現(xiàn)-在大小和底物類型上具有很大的靈活性，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)。

 

通過使用4D-Nucleofector^TM技術(shù)，實現(xiàn)封閉和可擴(kuò)展的轉(zhuǎn)染應(yīng)用。它可以很容易地從用于基礎(chǔ)研究或篩選目的的20-100ul小規(guī)模體系到高達(dá)20ml的后續(xù)應(yīng)用，例如用于細(xì)胞治療的體外修飾。

 

步驟2-讓你的免疫細(xì)胞循規(guī)蹈矩

 

不管底物遞送的方法是什么，免疫細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前的狀態(tài)決定了之后細(xì)胞的活性和功能。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染過程的反應(yīng)有多強(qiáng)烈或敏感，一方面取決于分離過程，另一方面也存在供體特性的問題。

 

能夠獲得血液或骨髓樣本以自我分離免疫細(xì)胞的研究人員，應(yīng)確保遵守既定的分離、刺激免疫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。嚴(yán)格按照說明操作將產(chǎn)生可比較和可重現(xiàn)的結(jié)果。

 

如果無法獲得這種來源，研究人員就會利用商業(yè)上可獲得的造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行研究。這有利于在質(zhì)量控制和優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)方面的工作。

 

然而，無論細(xì)胞的來源是什么，原代細(xì)胞都是來自單個有機(jī)體的細(xì)胞。捐贈者特定的差異是不可避免的，并將導(dǎo)致結(jié)果差異^[7]。

 

步驟3-準(zhǔn)備好穩(wěn)定的底物遞送
 

對于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來說，病毒顆粒的制備是復(fù)雜的，而用于改良電穿孔的底物選擇則更加多樣化。

 

為了確保最佳的條件，底物應(yīng)該是高質(zhì)量的。當(dāng)我們選擇質(zhì)粒DNA進(jìn)行基因遞送時，有許多需要考慮的方面，關(guān)于載體DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

 

底物的大小和濃度是這個游戲中的額外玩家。底物大小本身通常不是影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素，但當(dāng)質(zhì)粒大小超過約15kb時，效率會有所下降。因此，在轉(zhuǎn)染較大的質(zhì)粒時更要考慮實驗所需的DNA量和質(zhì)粒的完整性。增加每個反應(yīng)的DNA含量通常會提高轉(zhuǎn)染效率，但由于高濃度的DNA可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，細(xì)胞存活率可能會降低。對于Nucleofection實驗，推薦的底物濃度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之間。

 

關(guān)于推薦的Nucleofection條件，請在圖一找到找到免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化的圖表(圖1)。下面的表2總結(jié)了大多數(shù)這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件以及4D-Nucleofector^TM系統(tǒng)的參考文獻(xiàn)。

 

 

表2：人類原代免疫細(xì)胞Nucleofection條件、結(jié)果和參考文獻(xiàn)(OP：optimized protocol可用的優(yōu)化方案，IHD：in-house data基于內(nèi)部數(shù)據(jù))

 

龍沙致力于支持您對免疫系統(tǒng)的研究，這就是我們提供Nucleofector^TM技術(shù)和相應(yīng)的Nucleofector^TM試劑盒以高效轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞的原因。此外，我們還提供來自各種不同供體的造血和免疫細(xì)胞。

 

第二代Nucleofector^TM 裝置

 

4D-Nucleofector^TM X Unit ——適用于 100 µL 比色皿或 20 µL 16 孔試管中的各種細(xì)胞數(shù)量

4D-Nucleofector^TM Y Unit ——用于轉(zhuǎn)染 24 孔培養(yǎng)板的貼壁細(xì)胞

4D-Nucleofector^TM LV Unit ——用于封閉、可擴(kuò)展的大容量轉(zhuǎn)染多達(dá)1x10⁹ 個細(xì)胞

4D-Nucleofector^TM 96 孔裝置——一次同時轉(zhuǎn)染多達(dá)96 個樣品
 

Selected References:

1 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering

2 Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques

3 Nucleofection – Combining High Transfection Performance with Superior Preservation of Functionality

4 A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19

5 Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications

6 A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors

7 Human immune system variation

8 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells

9 Alterations in Cholesterol Metabolism Restrict HIV-1 Trans Infection in Nonprogressors

10 Altered expression of miR-181a and miR-146a does not change the expression of surface NCRs in human NK cells

11 Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo

12 Characterization of Programmed Death-1 Homologue-1 (PD-1H) Expression and Function in normal and HIV Infected Individuals

13 IL-27 inhibits HIV-1 infection in human macrophages by down-regulating host factor SPTBN1 during monocyte to macrophage differentiation

14 Generation of multivirus-specific T cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant