摘要
將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和人真皮成纖維細胞（HDFs）共培養(yǎng)和誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）單培養(yǎng)   分別包埋于選定的生物材料中7d。利用免疫熒光成像將這些三維培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞標(biāo)記與二維培養(yǎng)進行了比較，并證明了使用細胞相關(guān)材料的重要性。HUVEC與HDF共培養(yǎng)的時間是獲得復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重要因素。在3D      中延長培養(yǎng)時間導(dǎo)致觀察到促血管生成結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象只在3D中觀察到。與2D相比，iPSCs在3D培養(yǎng)時形成團簇，細胞組裝重塑，形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，并表達多能性標(biāo)記OCT4和NANOG。iPSCs可以在3D培養(yǎng)中保持其   多能性，這使得科學(xué)家可以設(shè)計更先進的實驗，在這種實驗中，干細胞可以在3D嵌入后進行分化。

介紹
由于整個 3D 矩陣中細胞自組裝和重組的差異，3D 生物打印和共培養(yǎng)類器官最近受到了廣泛關(guān)注。 單一培養(yǎng)類器官傾向于在 3D 中聚集以最大化粘附并最小化能量，而共培養(yǎng)則根據(jù)細胞間粘附的差異進行重組
（Foty，2005 年；Napolitano，2007 年）。 一般來說，不同的細胞類型在細胞重組過程中也會相互顯著影響。 例如，單獨的內(nèi)皮祖細胞不會形成血管組織，但當(dāng)與人真皮成纖維細胞(HDF) 或平滑肌細胞類型共培養(yǎng)時，血管內(nèi)皮管可以在多孔生物材料或生物墨水中形成 (Unger, 2007)。 一項使用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC) 的研究表明，這些細胞在沒有成纖維細胞的情況下無法形成內(nèi)皮細胞腔，這凸顯了共培養(yǎng)系統(tǒng)的重要性（Newman，2011）。
 
在研究過程中，對HUVEC培養(yǎng)的相關(guān)標(biāo)記進行了分析。分化簇31(CD31)是一種內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)記物，用于二維和三維培養(yǎng)中監(jiān)測內(nèi)皮細胞的分化、自組裝和血管生成。CD31在HUVECs表面表達，并已知在類有機分子內(nèi)自組織(Wu，2004)。occludens-1(ZO-1)是一種細胞質(zhì)蛋白，作為支架分子，是上皮細胞和內(nèi)皮細胞   緊密連接的組成部分。ZO-1氨基末端能與claudins和α-catenin/cadherins結(jié)合，羧基末端能與肌動蛋白細胞骨架相互作用(Itoh，1997)。表明在上皮細胞中，ZO-1是三維形成管腔所必需的。在排列的HUVEC三維培養(yǎng)中，ZO-1在緊密連接的功能性內(nèi)皮形成中發(fā)揮重要作用(Kang，2018)。
 
多能性標(biāo)記OCT4、SOX2和NANOG在維持胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能性干細胞（iPSCs）的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。證據(jù)表明，在分化和發(fā)育過程中，它們表達模式的改變控制著細胞的命運(Wang，2012)。例如，OCT4 調(diào)節(jié)BMP4通路并與之相互作用，以指定不同的發(fā)育命運。高水平的OCT4能在缺乏BMP4的情況下自我更新，但在存在BMP4的情況下指定中胚層。低水平的OCT4在沒有BMP4的情況下誘導(dǎo)胚胎外胚層分化，但在   有BMP4的情況下明確胚胎外譜系。SOX2抑制中胚層分化， 而NANOG抑制胚胎外胚層分化(Rizzino， 2016)。這表明了在3D基質(zhì)中嵌入iPSCs或在2D中培養(yǎng)時保持這些多能性標(biāo)記的重要性。
 
材料和方法
細胞制備
將HUVECs培養(yǎng)在大血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，添加生長補品(Cellworks，ZHM-2953)，并添加0.1%慶大霉素/ 兩性霉素抗生素(Gibco，R-015-10)。新生兒HDF在成纖維細胞生長培養(yǎng)基（促進細胞，C-23010)中培養(yǎng)。iPSCs按Celllatis's培養(yǎng)方案培養(yǎng)。iPSCs在Synthemax II-SC基質(zhì)（Corning,3535）涂層上培養(yǎng)，并用Versene溶液（Gibco,15040-033）分離。培養(yǎng)基為Cellartis DEF-CS 500無Xeno培養(yǎng)基（Takara Bio，Y30045)，添加添加劑（Takara Bio，Y30042)和1%慶大霉素/兩性霉素(Gibco，R-015-10)。

生物墨水的制備與生物打印
對于HUVEC-HDF生物打印，將GFP標(biāo)記的HUVEC細胞以1：1的比例與HDFs混合，并與bioink、Matrigel Matrix(Corning，354234)或GelMA(CELLINK，IK305102)混合，以200萬細胞/ml的比例添加纖維連接蛋白， bioink與細胞的比例為9：1。bioink和細胞在兩個注射器之間混合，然后通過連接的22g噴嘴(CELLINK， NZ4220005001)分配。Gelma基樣品在3 cm處光交聯(lián)15秒，Matrigel基樣品在37℃下熱交聯(lián)20分鐘后加入介質(zhì)。在每周更換3次的HUVECs培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
對于iPSCs生物打印，細胞以100萬個細胞/ml的比例在兩個注射器之間以10：1的比例bioink（Matrigel或
GelMA ， 補 充 層 粘 連 蛋 白 521(GelMA+LN521)) 與 細 胞 （ V/V ） 混 合 ， 并 通 過 20g 噴 嘴
（CELLINK,NZ4200005001)分配。GelMA光交聯(lián)5～10秒，Matrigel熱交聯(lián)。培養(yǎng)基每天更換。
一般情況下，所有樣品在未經(jīng)處理的96孔板(VWR，7342781)中以液滴形式生物打印，使用
BIO X（CELLINK,D16110020717)和在100微升相應(yīng)生長培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)所有的光交聯(lián)都是在405nm的光模塊上進行的。2D細胞在腔室細胞上培養(yǎng)
培養(yǎng)幻燈片(Falcon，354108)。所有培養(yǎng)物均保持在37°C和5%CO2下。分別于3d和2d培養(yǎng)5～14d和3～4d， 用免疫組織化學(xué)(IHC)分析不同標(biāo)記物的表達。

免疫染色
用4%多聚甲醛（CaCl2 50 mM）固定5～6小時，然后用乙醇和二甲苯脫水。在用切片機切片至5μm厚之前，用石蠟浸潤和包埋這些結(jié)構(gòu)。切片在顯微鏡載玻片上固定，并在二甲苯和乙醇中分離。用抗原回收緩   沖液煮沸制備抗體染色樣品，然后用封閉液處理。2D細胞固定1～3h，用0.5%Triton-X100滲透，用封閉液   處理。將一抗溶液加入所有玻片中，在4℃下孵育過夜。切片經(jīng)PBS洗滌后，在室溫下用二次抗體處理1h。細胞核用NucBlue固定細胞ReadyProbes試劑(Invitrogen，R37606)反染。將蓋片安裝在載玻片上，并附上氟蒙特-G(Invitrogen，00-4958-02)。用熒光共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM710 NLO）在相同的采集參數(shù)下分析次級抗體的定位。

結(jié)果和討論
HUVEC-HDF共培養(yǎng)：為了確定不同基質(zhì)對HUVECs和HDF共培養(yǎng)的影響，首先用熒光顯微鏡觀察其形態(tài)差異。生長在Matrigel和GelMA纖維連接蛋白中的細胞形成致密的網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)為細長的表型，而2D細胞表現(xiàn)為   細長較少而圓形較多的形態(tài)（圖1）。此外，二維圖像顯示GFP-HUVECs在少數(shù)上皮細胞中呈簇狀分布。
  圖1.GFP 標(biāo)記的 HUVEC（綠色）在 2D 單層（第 3 天）和Matrigel（第 7 天）和 GelMA 纖連蛋白（第 14 天）上的 3D 培養(yǎng)中與 HDF 共培養(yǎng)。 比例尺= 100 µm。
 
ZO-1染色：除了細胞形態(tài)外，緊密連接在內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。為此，對緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1進行免疫染色，分析其在2D和不同3D基質(zhì)中的細胞分布。如圖2所示， 在第15 天，在GelMA纖維連接蛋白Sam-ples 中檢測到高水平的ZO-1。在GelMA 纖維-果膠樣品中也觀察到幾個芽， 表明這些細胞具有形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)的能力。有趣的是，ZO-1二維染色不僅局限于HUVECs ， 也可在HDFs中檢測到， 提示一個含有合適ECM成分的三維環(huán)境對維持不同細胞系蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和時空表達是必要的。
  圖2.GFP-HUVEC和HDF共培養(yǎng)2d（第3天）和Matrigel
（第8天）和GelMA纖維連接蛋白（第15天）分別用ZO- 1（紅色）和DAPI（藍色）染色。比例尺=100μm。
 
CD31染色：為進一步鑒定共培養(yǎng)物，對特異性內(nèi)皮標(biāo)記物CD31進行免疫熒光染色。毫不奇怪，CD31的表達僅限于2D 和 GelMA 纖 維 連 接 蛋 白 第 15 天 的HUVECs，這可以通過重疊表達GFP和CD31/DAPI 的HUVECs 圖像面板顯示（圖3）。不幸的是，在atrigel第8天培養(yǎng)中檢測到非常低水平的CD31，這可以由GFP信號所示的視野中HUVECs細胞的非常低數(shù)量或缺乏來解釋（圖3）。
  圖3.GFP-HUVEC與HDF共培養(yǎng)2d(3d)、3d、3d，CD31（紅）、DAPI（藍）染色，Matrigel(8d)、GelMA纖維連 接蛋白(15d)染色。比例尺=100μm。
   
圖4.在3DMatrigel或Gelma+LN521中對培養(yǎng)4d后的iPSCs進行2d和7d的亮場圖像。比例尺=100μm。
 
接下來，用亮場顯微鏡觀察生長在2D和3D簇中的iPSC細胞的形態(tài)，如圖4所示。在Matrigel和Gelma+LN521 中均觀察到不同大小的球體。此外，還對三個多能性標(biāo)記OCT4、NANOG和SOX2的表達進行了評估。

多能性標(biāo)記物 OCT4 在所有條件下都有不同程度的表達，如圖 5（上圖）所示。在 2D 中，在細胞簇的周邊觀察到最高的信號強度。而在 Matrigel 中，信號強度均勻分布在整個樣品上。對于圖 5（ 中圖）中的NANOG 染色樣品，觀察到非常相似的表達模式。需要更長的曝光時間來可視化圖 5（下圖）所示的 2D 樣品中的 SOX2 表達。除了多能標(biāo)記物的表達外，還觀察到 GelMA+LN521 中細胞簇的環(huán)狀形態(tài)，主要是在Matrigel 中。這些空心簇類似于神經(jīng)玫瑰花結(jié)或早期中胚層結(jié)構(gòu)（Muratore，2014）。然而，需要進一步分析以確認(rèn)任何潛在的分化，因為iPSC 在觀察到細胞聚集的所有條件下都保留了 OCT4 和 NANOG 的表達。這些多能性標(biāo)記物不是所有分化命運的泛阻遏物，而是每個控制向特定譜系的分化。例如，NANOG 抑制胚胎外胚層分化而對其他譜系幾乎沒有影響，而SOX2 抑制中內(nèi)胚層分化（Wang，2012）。轉(zhuǎn)錄因子小心翼翼地相互作用以將細胞保持在多能狀態(tài)，與其他因子相比， 一種因子表達的微小變化可導(dǎo)致分化
（Rizzino，2016 年）。免疫熒光觀察到的微小變化不是定量的，但表明即使在嵌入和 3D 生物打印后仍保留了多能性標(biāo)記，為 3D 生物打印過程后的分化開辟了新的機會。
  圖 5. 2D 培養(yǎng) 4 天和 3D Matrigel 或GelMA+LN521 培養(yǎng) 7 天后 iPSC 中的OCT4、NANOG 和 SOX2 表達。 所有圖像均使用相同的采集參數(shù)捕獲，但SOX2 的 2D 圖像已為可視化進行了增強。 比例尺 = 100 µm。
 
結(jié)論和今后的方向
與二維細胞培養(yǎng)相比，3D生物打印顯示出多種優(yōu)勢，包括多細胞結(jié)構(gòu)的精確幾何排列，可以更好地再現(xiàn)自然的三維人體生理學(xué)。細胞根據(jù)來自周圍細胞和環(huán)境的外部信號進行自組裝。這一重要現(xiàn)象有助于理解胚   胎發(fā)生、血管生成、傷口愈合和腫瘤形成，也可能有助于開發(fā)新的生物人工器官血管化藥物和途徑。這項   研究得出以下結(jié)論：
· 三維環(huán)境對于HUVECS復(fù)雜結(jié)構(gòu)的發(fā)展和網(wǎng)絡(luò)形成至關(guān)重要。
· 三維培養(yǎng)時，iPSCs形成團簇，重塑細胞組裝，形成環(huán)面狀結(jié)構(gòu)。在2D控制中沒有觀察到類似的iPSCs重排。
· 在2D和3D中，iPSCs表達多能性標(biāo)記OCT4和NANOG,而SOX2在2D中的表達低于3D。
· iPSCs可以在3D培養(yǎng)中保持其多能性，這使得科學(xué)家可以設(shè)計更先進的實驗，在3D嵌入后可以進行干細胞分化。

參考文獻
1. Foty RA, Steinberg MS. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. 
Developmental Biology. 2005; 278(1): 255–263. DOI:10.1016/j.ydbio.2004.11.012.

2. Napolitano AP, Chai P, Dean DM, Morgan JR. Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels. Tissue Engineering. 
2007; 13(8): 2087–2094. DOI:10.1089/ten.2006.0190.

3. Unger RE, Sartoris A, Peters K, et al. Tissue-like self-assembly in cocultures of endothelial cells and osteoblasts and the formation of microcapillary-like structures on three-dimensional porous biomaterials. Biomaterials. 2007; 28(27): 3965–3976. DOI:10.1016/j.biomaterials.2007.05.032.​

· Newman AC, Nakatsu MN, Chou W, et al. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: Fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 2011; 22(20): 3791– 3800. DOI:10.1091/mbc.E11-05-0393.

· Wu X, Rabkin-Aikawa E, Guleserian KJ, et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 2004; 287(2): H480–7. DOI:10.1152/ajpheart.01232.2003.

· Itoh M, Nagafuchi A, Moroi S, Tsukita S. Involvement of ZO-1 in cadherin-based cell adhesion through its direct binding to alpha catenin and actin filaments. The Journal of Cell Biology. 1997; 138(1): 181 – 192. DOI:10.1083/jcb.138.1.181.

· Kang B, Shin J, Park H-J, et al. High-resolution acoustophoretic 3D cell patterning to construct functional collateral cylindroids for ischemia therapy. Nature Communications. 2018; 9(1): 5402. DOI:10.1038/s41467-018-07823-5.

· Wang Z, Oron E, Nelson B, et al. Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, and SOX2 in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2012; 10(4): 440–454. DOI:10.1016/j.stem.2012.02.016.

· Rizzino A, Wuebben EL. Sox2/Oct4: A delicately balanced partnership in pluripotent stem cells and embryogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 2016; 1859(6): 780–791. DOI:10.1016/j.bbagrm.2016.03.006.

· Muratore CR, Srikanth P, Callahan DG, Young-Pearse TL. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS One. 2014; 9(8): e105807. DOI:10.1371/journal.pone.0105807.