摘要
自然殺傷(NK)細胞是一種先天免疫細胞，通過發(fā)揮細胞毒性作用，在清除轉化或癌變細胞方面發(fā)揮著重要作用。近年來，一些免疫刺激分子和生物制劑被用來提高NK細胞的溶瘤作用。三維(3D)細胞培養(yǎng)技術已經(jīng)發(fā)展到更好地概括體內結構和生理相關性，以評價這些藥物和生物制劑的體外。在這個概念驗證研究中，我們開發(fā)了一個三維生物打印的子宮頸癌腫瘤模型，以證明NK細胞的細胞毒活性。用Ⅰ型膠原3D生物打印GFP標記的人宮頸癌細胞SiHa和CaSki，并與人外周血源性NK細胞共培養(yǎng)96h。NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性作用通過熒光顯像進行評估，顯示在NK細胞濃度增加的情況下，腫瘤殺傷程度更高。本文描述的方法是可縮放的，與高含量成像兼容，并且容易翻譯到其他腫瘤模型。

介紹
自然殺傷(NK)細胞是先天免疫系統(tǒng)中的一種細胞毒性效應細胞，利用一系列預先確定的種系編碼受體來感知病原體和轉化細胞，包括腫瘤細胞。與細胞毒性T淋巴細胞不同，NK細胞不需要腫瘤抗原特異性激活，而是在腫瘤細胞表面尋找“缺失的自我”受體，如MHC I類分子。NK細胞的溶細胞活性是由細胞表面受體傳遞激活或抑制信號的相對平衡調節(jié)的。在正常生理條件下，健康細胞表面的MHC I類分子與NK細胞上的抑制受體相互作用，而與此同時，與NK細胞上的激活受體相互作用的激活配體較少（圖1）。然而，抑制信   號超過激活信號，導致自我耐受(Long，2013)。腫瘤細胞傾向于下調MHC I類分子以逃避T細胞介導的殺傷，從而變得容易發(fā)生NK細胞介導的細胞毒性(Garrido，2016)。自然殺傷細胞的傳統(tǒng)特征是存在CD56細胞表面標記物，而缺乏CD3。此外，CD16對NK細胞的功能也很重要，因為CD16能誘導細胞因子的表達和細胞毒效應物的活性。

NK細胞向實體瘤的浸潤在許多癌癥適應癥中與更好的預后相關，包括非小細胞肺癌、結直腸癌和宮頸癌(Burke，2010)。這些腫瘤組織的細胞和細胞外基質(ECM)的組成被認為在NK細胞的細胞毒和浸潤功能中起著至關重要的作用，這些功能在體外模型研究中往往具有挑戰(zhàn)性。

研究了幾種三維腫瘤模型， 包括球體、懸吊液滴和微流控芯片模型，用于NK細胞毒性試驗。例如， Giannattasio(2015)報道了一個子宮頸癌的球體模型來研究離體NK細胞殺傷效率。他（2014）使用旋轉細胞   培養(yǎng)系統(tǒng)產生大量均勻的球體用于NK細胞殺傷試驗。雖然這些模型模擬了體內環(huán)境的某些方面和一定程度的穿透，但它們中的許多沒有考慮ECM在腫瘤生物學中的關鍵作用。

3D生物打印是一項新興技術，它使研究人員能夠自動化地制造腫瘤結構，以篩選抗癌藥物或免疫刺激劑。該技術分配一種細胞負載的ECM材料，或生物墨水，與腫瘤細胞混合，隨后化學或熱固化，以提供印刷結構的機械強度。

在此，我們探索三維生物打印技術在NK細胞毒性分析中的潛力，以幫助評價離體NK細胞的細胞毒性。用Ⅰ 型膠原3D生物印跡GFP標記的人宮頸癌細胞SiHa和CaSki，并與人外周血源性NK細胞共培養(yǎng)。NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性效應用熒光成像進行評估，顯示在NK細胞濃度增加的情況下，腫瘤殺傷程度更高。這里描述的方法是可擴展的，與高含量成像兼容，并容易翻譯到其他腫瘤模型。

材料和方法
細胞及細胞系制備
人宮頸癌細胞株SiHa(ATCC HTB-35) 和CaSki(ATCC CRL-1550) 來源于ATCC。SiHa和CaSki細胞分別在EMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基中，添加10%熱滅活FBS和1%PEN/STREP溶液。SiHa和CaSki細胞是用GFP編碼的慢病毒轉導的(Kercher，2020)。轉導后72小時，用FACSaria（BD Biosciences）細胞分選器對穩(wěn)定的GFP 表達細胞進行分選。取健康供者外周血原代人NK細胞(2W-501，Lonza)，陰性選擇，冷凍保存。將NK細胞解凍后在LGM-3淋巴細胞生長培養(yǎng)基(Lonza，CC-3211)中培養(yǎng)，并加入500U/ml人重組IL-2(PeproTech,200- 02）。所有細胞均在含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中保持在37℃。
 

圖1.三維生物打印NK細胞毒性試驗。(A)NK細胞介導的細胞毒性機制：NK細胞在腫瘤細胞表面尋找“缺失的自身”受體，如MHC一類分子。NK細胞的溶細胞活性是由細胞表面受體傳遞激活或抑制信號的相 對平衡調節(jié)的。(B)宮頸腫瘤的3D生物打印。利用BIO X的液滴打印功能對SiHa和CaSki細胞進行生物打印，將膠原液滴（腫瘤模型）熱凝并在培養(yǎng)液中維持4d后與NK細胞共培養(yǎng)。

生物墨水的制備與生物打印
膠原I（Coll-1,CELLINK）被中和，并按照制造商的說明與每毫升膠原1×106 SiHa或CaSki細胞混合。所有部件，包括注射器、針頭和針尖都放在冰上，直到準備使用。溫度控制打印頭(TCPH)被設置為8°C，被打印的   被設置為10°C。在96孔板(n=3)中使用BIO X（軟件版本1.8）上的液滴功能分配~8μL細胞-膠原懸浮液（見圖1b)進行三維(3D)SiHa或CaSki腫瘤的生物打�。ㄒ妶D1b)。1毫升細胞-膠原懸浮液的總體積足以在96孔板中打印腫瘤液滴。印刷后，將96孔板轉移到37°C加濕培養(yǎng)箱中20分鐘，以允許膠原聚合。接下來，在每個井中添加200μL的EMEM（SiHa）或RPMI-1640（CaSki）介質。媒體每2天刷新一次。在第5天與NK細胞共培養(yǎng)前，培養(yǎng)4天。第4天，一些樣品用Alexa面粉647結合的鬼筆苷染色肌動蛋白。

3D共培養(yǎng)試驗
第5天，沖洗打印出來的腫瘤，在200μL的LGM-3生長培養(yǎng)基中，在IL-2存在下，以不同效應靶比（E：T）
（0-20）與NK細胞共培養(yǎng)72小時。陽性對照組分別與足葉乙甙或TNFα孵育，誘導細胞凋亡。陰性對照組未接受任何NK細胞或凋亡誘導劑。

成像與統(tǒng)計
在試驗結束時，打印出來的腫瘤在顯像前用碘化丙啶(PI)染色10分鐘。PI用DPBS洗滌兩次，去除松散粘附/ 死亡的NK細胞。GFP熒光的丟失和PI信號的升高被用作先前描述的腫瘤細胞死亡的讀出(Kercher，2020)。成像是用連接到單色相機的表熒光顯微鏡進行的。用美國國立衛(wèi)生研究院ImageJ軟件測量熒光強度，用GraphPad棱鏡8翻譯并制作圖形。結果用學生t檢驗在棱鏡上進行統(tǒng)計學測量，數(shù)據(jù)用均值±SEM表示。
   
圖2.用慢病毒轉導人宮頸癌SiHa和CaSki細胞表達GFP。（A-D）SiHa和CaSki細胞在二維單層上生長， 用亮場(BF)和GFP通道成像。（E-F）GFP表達細胞與I型膠原和3D型膠原混合，在96孔板中進行生物打印。3D結構的圖像在第4天被捕獲。（G-H）第4天，腫瘤標本用Alexa面粉647-結合鬼筆苷染色�？潭葪l=100μm。

結果和討論
腫瘤細胞生長與生物標記腫瘤形成
BIO X上的液滴功能能夠自動在96孔板中分配一致的膠原-腫瘤液滴。液滴形狀的均勻性和良好的放置有助于整個顯微鏡和分析工作流程。3d生物打印的腫瘤液滴進行GFP熒光成像，并用PI染色測定   細胞活力。圖2所示的結果表明，在第4天，宮頸癌細胞在打印的腫瘤中是可行的。Phalloidin染色
（圖2G-H)顯示三維生物打印腫瘤內細胞周圍有特征性肌動蛋白積累。
   
圖 3. 3D 中的NK 細胞細胞毒性測定。 (A) CaSki 細胞經(jīng)過 3D 生物打印并與NK 細胞共培養(yǎng)。 明場圖像顯示打印腫瘤周圍浸潤的 NK 細胞。 (B) 在共培養(yǎng)結束時，生物打印的腫瘤被 PI 染色，用 GFP 和 PI 通道捕獲圖像并使用ImageJ 合并。(C) 一系列E:T 比率(0 到 20) 用于共培養(yǎng)。 SiHa（頂部）和CaSki（底部） 細胞的生物打印腫瘤模型均顯示出腫瘤細胞活力的NK 細胞劑量依賴性降低。 比例尺= 100 µm。
 
腫瘤與NK共培養(yǎng)及細胞毒性分析
對NK細胞介導的細胞毒性進行了定性和定量驗證。共培養(yǎng)的亮場圖像顯示了SiHa和CaSki細胞類型的腫瘤與NK細胞的相互作用（圖3A)。在熒光成像和定量后，觀察到NK細胞濃度依賴性的腫瘤細胞   存活率下降。在20:1(E:T)比下，觀察到與no NK對照組相比，腫瘤存活率降低(~60%-70%)有統(tǒng)計學意義(P=0.0003)。圖3顯示了有無NK細胞的印刷腫瘤SiHa和CaSki的代表性圖像，當NK細胞存在于共培養(yǎng)中時，GFP熒光質量下降。最有趣的是，在NK細胞存在的情況下，打印腫瘤的外周顯示GFP熒光的最大減少（圖4)，表明NK細胞浸潤到打印腫瘤的膠原基質中。然而，對NK細胞進行特異性染   色是確認NK細胞浸潤程度所必需的。
   
圖4. 腫瘤細胞殺傷模式。 在沒有NK 細胞的情況下，SiHa 腫瘤表達明亮的 GFP 熒光。 然而，當與NK 細胞共培養(yǎng)時，整體 GFP 熒光強度降低，這在打印腫瘤的外同心環(huán)（白色箭頭指示的白色虛線）（右圖）中是顯著的。比例尺 = 500 µm。

結論和今后的方向
Ø 液滴三維生物打印技術可以作為一種自動化的過程，以人宮頸癌細胞SiHa和CaSki為代表的多功能體內模型，以促進免疫腫瘤學研究。
Ø 在與人NK細胞共培養(yǎng)的過程中，3D生物打印的腫瘤細胞在膠原基質中保持受限和存活。
Ø 在細胞毒性試驗中，人外周血來源的NK細胞顯示出細胞濃度（E：T比值）依賴性的癌細胞殺傷增加。
Ø NK細胞細胞毒性試驗與高含量成像工作流程兼容，也可適用于其他腫瘤模型，包括PDX有機化合物，以加速藥物篩選過程，并推動個性化藥物的臨床翻譯。
Ø 此外，BIO X上的多壁生物打印格式可用于擴大對生物制劑（如免疫檢查點抑制劑）和工程NK細胞（CAR-NK）的高通量篩選的支持。
Ø 進一步的研究可能包括定量腫瘤中NK細胞的浸潤和腫瘤或T細胞釋放的細胞因子。
 
參考文獻

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