上一篇文章跟大家介紹了qPCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)及加樣的相關(guān)操作技巧，今天我們?cè)俑�大家分享其他的�?shí)用技巧，這些入門級(jí)知識(shí)一定要掌握牢固哦。
 

1、陰性對(duì)照的技巧：

陰性對(duì)照一般是指用水代替模板的反應(yīng)孔，體系中除了模板，包括了其他的反應(yīng)組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對(duì)照有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的情況，那么在針對(duì)這類問題時(shí)，我們需要判斷其原因所在。
 

使用染料法進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先查看陰性對(duì)照的溶解曲線主峰是否跟陽性孔的主峰位置一致。如果一致，要看兩者Cq相差多少，比如，針對(duì)某一種引物的實(shí)驗(yàn)樣品Cq值為28. 5，陰性對(duì)照的Cq值為33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的擴(kuò)增效率計(jì)算，兩者模板量相差28倍之多，對(duì)分析數(shù)據(jù)影響不大，所以實(shí)驗(yàn)樣品的Cq值還是可以采用的；但是，如果兩者的Cq值僅相差 1~2，這說明陰性對(duì)照中有較大的模板污染，則需要考慮更換試劑或引物，分區(qū)加樣，重新實(shí)驗(yàn)。如果不一致，陰性對(duì)照主峰對(duì)應(yīng)的Tm值小于陽性孔的Tm值，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴(kuò)增效率。
 

▲ 圖1：溶解曲線主峰位置基本一致時(shí)，S3是實(shí)驗(yàn)樣品，NTC是陰性對(duì)照，

兩者Cq相差大于5，實(shí)驗(yàn)樣品的Cq值還是可以采用的。
 

▲ 圖2：溶解曲線主峰位置不一致時(shí)，STD-1是高濃度樣品，STD-5是中濃度樣品，

STD-8是低濃度樣品，NTC是陰性對(duì)照。隨著模板濃度降低逐漸出現(xiàn)引物二聚體，
導(dǎo)致擴(kuò)增效率測(cè)得不準(zhǔn)確。
 

使用TaqMan探針法進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于探針法的高特異性，如果陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，很大可能是模板污染或氣溶膠污染導(dǎo)致，操作時(shí)注意分區(qū)加樣，避免污染。
 

2、結(jié)果分析的技巧：

進(jìn)行相對(duì)定量分析時(shí)，最常用到的是 2-ΔΔCq法，但是這種方法比較粗放，因?yàn)樗�的前提是假定所有引物的擴(kuò)增效率都為100%。更為準(zhǔn)確的定量則需要考慮不同引物擴(kuò)增效率的差別�？墒紫扔锰荻认♂尩哪０鍦y(cè)試各引物的擴(kuò)增效率E，獲得實(shí)際擴(kuò)增效率之后，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只需要在軟件中直接輸入擴(kuò)增效率E值，即可計(jì)算更精準(zhǔn)的相對(duì)定量值。
 

在Azure Cielo™ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中可在分析界面輸入擴(kuò)增效率E值，完成更精準(zhǔn)的相對(duì)定量值的計(jì)算，如圖所示：
 

Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來自于美國(guó)Azure Biosystems公司，配備高品質(zhì)溫度模塊，采用光纖和CMOS的檢測(cè)系統(tǒng)，高能LED的激發(fā)，提供高靈敏和可靠的數(shù)據(jù)。
 

▲ Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)