目前用于分離BMSCs的方法主要有五種，分別是貼壁篩選法、骨組織消化法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分離法。

上篇我們介紹了貼壁篩選法、骨組織消化法的原理和特點(diǎn)，這篇就和大家介紹其他三種分離方法：密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分離法，一起為您的實(shí)驗(yàn)挑選合適的分離方法吧！
 

01 密度梯度離心法

密度梯度離心法是針對(duì)骨髓中不同細(xì)胞的大小和密度差異進(jìn)行分選，骨髓細(xì)胞懸液加入到密度梯度離心液上面，通過離心使得不同類型細(xì)胞沉降至其等密度點(diǎn)，然后吸取特定位置富集的細(xì)胞。

常見的梯度離心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，具有低粘性和低滲透性的特性，使用密度約為1.077g/mL。在離心分層時(shí)，紅細(xì)胞及多核細(xì)胞因比重(1.080g/mL) 較大而沉降于底部，其次是單個(gè)核細(xì)胞（包括BMSCs、造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞等） ，懸浮密度位于(1.056~1.075) g/mL，血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050g/mL。位于分離液之上的灰白色云霧狀層即為單個(gè)核細(xì)胞層，在獲取該層細(xì)胞后再通過差速貼壁法去除未貼壁細(xì)胞（如圖1）。

圖1. 密度梯度離心法分離BMSCs
 

使用密度梯度離心法分離BMSCs效果好，但操作嚴(yán)格，不易掌握。
 

02 免疫磁珠分選法

免疫磁珠分選法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合的原理。在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

免疫磁珠分選法分為正選法和負(fù)選法。在正選法中，磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞；而在負(fù)選法中，磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞即為所需目的細(xì)胞。

圖2. 免疫磁珠分選法分離BMSCs
 

由于目前BMSCs表面缺乏特異性抗原，暫時(shí)無法進(jìn)行正選，故需采用CD11b負(fù)選法。CD11b被認(rèn)為是粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其實(shí)CD11b在巨噬細(xì)胞等表面也有大量分布，而且表達(dá)的量和粒細(xì)胞差不多。鑒于骨髓基質(zhì)細(xì)胞中有核雜細(xì)胞，主要為中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，因此可以采取CD11b負(fù)選法來去除這些雜細(xì)胞，從而獲得目的細(xì)胞BMSCs。

免疫磁珠分選法也是一種簡(jiǎn)單高效的分離方法，僅需磁性分離器，不需要專業(yè)設(shè)備輔助，分離獲得BMSCs細(xì)胞通量高。
 

03 流式細(xì)胞儀分離法

流式細(xì)胞儀分離法原理是：當(dāng)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的單細(xì)胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動(dòng)下，細(xì)胞被排成單列，以一定速度從流動(dòng)室噴口噴出。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻的壓電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。
 

圖3. 流式細(xì)胞儀分離法原理(Hai-jian Sun, Jian Chen, Bing Ni.et al.2015)

這種方法需要流式儀器輔助操作，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，技術(shù)難度較高。且對(duì)細(xì)胞刺激大，易污染。
 

總結(jié)

五種培養(yǎng)方法各有利弊，小伙伴們可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹��?shí)驗(yàn)室條件及實(shí)驗(yàn)周期選擇一個(gè)最合適的方法。

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原文檢索：

Hai-jian Sun, Jian Chen, Bing Ni, Xia Yang, Yu-zhang Wu, Recent advances and current issues in single-cell sequencing of tumors, Cancer Letters(2015), doi: 10.1016/j.canlet.2015.04.022.