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微流控毛細(xì)管電泳法在藥物研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控上的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)舉例

瀏覽次數(shù):3763 發(fā)布日期:2021-8-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程非常復(fù)雜,有諸多技術(shù)瓶頸,如全人源抗體篩選核心技術(shù)平臺(tái)的建立和制備、高表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白純化工藝步驟及過程對(duì)產(chǎn)品純度和各項(xiàng)理化特性的影響等。因此,無論是FDA提出的質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)原則,還是我國(guó)的《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》,都對(duì)生物大分子藥物的工藝開發(fā)提出了更高的要求。現(xiàn)在QbD理念已經(jīng)普遍被國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)認(rèn)可和推崇,它強(qiáng)調(diào)需要確定并理解影響蛋白藥物療效的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。嚴(yán)格地監(jiān)督和控制這些屬性,有助于確保穩(wěn)定的、更加可預(yù)測(cè)的研發(fā)和工藝流程。


針對(duì)生物大分子藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程的篩選與質(zhì)控,基于微流控技術(shù)的LabChip® GXII Touch能夠?qū)?xì)胞培養(yǎng)液上清及純化后的抗體、融合蛋白的滴度、純度、糖基化程度、片段化及聚合、糖譜、電荷異質(zhì)性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)、自動(dòng)化的定性定量分析,以及克隆構(gòu)建過程中的DNA、RNA分析。每個(gè)樣品的分析時(shí)間耗時(shí)少至42秒,提供可以媲美傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳的數(shù)據(jù)同時(shí),通量增加70倍。

 

01 純度檢測(cè)

目前,監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)品質(zhì)量的方法包括SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳(CE)和HPLC。SDS-PAGE勞動(dòng)強(qiáng)度大,且難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,在現(xiàn)代分析實(shí)驗(yàn)室中已被基于CE的分析方法代替。CE和HPLC分析需要15-60分鐘/樣品分離時(shí)間,一定程度上限制了DOE研究。在過去的十幾年中,基于微流控的檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的大小測(cè)定、定量和純度評(píng)估,因?yàn)樗行Ы鉀Q了SDS-PAGE、HPLC和CE方法的局限性。

 

圖1:Micochip與傳統(tǒng)CE-SDS方法的比較。還原單抗樣品同時(shí)利用 (A) LabChip® 90和 (B) Proteomelab PA800進(jìn)行分析

 

美國(guó)Amgen公司分析與制劑科學(xué)部門2008年在Electrophoresis雜志上發(fā)表的文章中[1],對(duì)使用LabChip技術(shù)篩選mAb產(chǎn)品質(zhì)量屬性進(jìn)行了研究。他們?cè)谶原和非還原條件下分析了來自CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清粗提液的mAb和純化產(chǎn)物,所得分辨率和靈敏度與傳統(tǒng)CE-SDS相似,但分析速率要快大約70倍(42秒 vs 50分鐘/樣品,如圖1)。Amgen研發(fā)人員在該文章中使用HT Protein Express  assay對(duì)粗提樣品中的非糖基化重鏈(NGHC)進(jìn)行定量分析,以測(cè)定高甘露糖的相對(duì)含量。他們最終得出結(jié)論,該實(shí)驗(yàn)可為早期細(xì)胞培養(yǎng)篩選提供有價(jià)值的反饋。

 

微流控毛細(xì)管電泳方法用于單抗藥物生產(chǎn)質(zhì)控和放行分析

 

美國(guó)GSK公司生物制藥分析科學(xué)部門2017年在Electrophoresis雜志上發(fā)表的文章中指出[2],他們已經(jīng)成功將微流控毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法貫穿應(yīng)用在整個(gè)單克隆抗體產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控流程中,包括前期研發(fā)以及后期cGMP(現(xiàn)行藥品生產(chǎn)管理規(guī)范)放行和穩(wěn)定性測(cè)試。整個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試是在LabChip® GXII Touch系統(tǒng)上采用HT Protein Express assay檢測(cè)完成。

 

LabChip® GXII Touch系統(tǒng)檢測(cè)mAb樣本的還原以及非還原結(jié)果均符合DOE系統(tǒng)適應(yīng)性以及樣本驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn),典型圖譜如圖2a和2b所示。

 

圖2a.還原樣品電泳圖-mAB1  圖2b.非還原樣品電泳圖-mAB1

 

高分辨率蛋白純度分析——進(jìn)一步滿足生產(chǎn)質(zhì)控的高要求

基于LabChip® GXII Touch微流控平臺(tái)的Protein Clear HR assay是專為mAb研發(fā)和生產(chǎn)過程中的高分辨率蛋白純度分析而設(shè)計(jì)開發(fā)的,能夠可視化地檢測(cè)樣品中低至5ng/μL的雜質(zhì)。它在Protein Express assay的基礎(chǔ)上,更加提升性能,使得樣本純度分析的重復(fù)性更上一層樓,可以進(jìn)一步滿足生產(chǎn)質(zhì)控的高要求。利用LabChip® GXII Touch系統(tǒng)的分析能力和速度,以及IntelliChip的實(shí)驗(yàn)參數(shù)自動(dòng)反饋優(yōu)化技術(shù),您可以擁有無以倫比的通量和重現(xiàn)性,從而加速蛋白研發(fā)流程。

 

02 糖譜分析

糖基化等轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)于蛋白質(zhì)功能有很重要的作用,它會(huì)影響治療性抗體的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效以及安全性等。抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基、pH值、溫度等條件的變化都會(huì)影響糖基化的結(jié)構(gòu)。因此,各家藥物生產(chǎn)商必須在研發(fā)和生產(chǎn)中不斷對(duì)糖型進(jìn)行檢測(cè)分析。如果用傳統(tǒng)的HPLC,CE-LIF技術(shù)或者質(zhì)譜技術(shù)來分析N-糖型,通常需要2-3天的時(shí)間來進(jìn)行消化、標(biāo)記和分析,而利用一體式的標(biāo)準(zhǔn)Profiler Pro Glycan試劑盒,在LabChip® GXII Touch上實(shí)現(xiàn)高分辨率的分離檢測(cè),96個(gè)樣品可以在不到6個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成。每個(gè)樣品檢測(cè)可在45秒內(nèi)完成,且只需要8μL樣品。同時(shí)LabChip芯片和試劑盒適用于多次檢測(cè),單次芯片制備最多可運(yùn)行192個(gè)樣品。


圖3. 糖譜分析圖

 

03 電荷異質(zhì)性分析

LabChip® GXII Touch技術(shù)可用于鑒定相對(duì)于mAb主峰的堿性和酸性變體,其結(jié)果生成速度比常規(guī)IEX(離子交換色譜)和CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)快15倍,且能夠自動(dòng)計(jì)算變體的相對(duì)百分比。更大的通量意味著您可優(yōu)化使用寶貴的研究時(shí)間,使藥物更快進(jìn)入到臨床。


圖4. LabChip® GXII Touch荷電異質(zhì)實(shí)驗(yàn)(左圖)與傳統(tǒng)CZE實(shí)驗(yàn)(右圖)的比較。堿性區(qū)的遷移快于主峰,而酸性區(qū)遷移則較慢。用戶可使用系統(tǒng)軟件工具“Expected Peak”命名各樣品峰,各變體的相對(duì)百分含量自動(dòng)以表格形式顯示。

 

LabChip® GXII Touch系統(tǒng)能快速分析蛋白樣品的純度、滴度、糖基化程度、糖譜分析、電荷異質(zhì)性等多項(xiàng)關(guān)鍵質(zhì)量屬性,為生物治療藥物研發(fā)和生產(chǎn)流程的各個(gè)環(huán)節(jié)提供快速分析和樣品質(zhì)控。同時(shí)也該系統(tǒng)可以對(duì)DNA、RNA、Small RNA等核酸樣品進(jìn)行片段分析及質(zhì)控。

 

除了微流控平臺(tái)外,我們還可以利用多模式平臺(tái),結(jié)合靈活、靈敏的HTRF和ALPHA等技術(shù),針對(duì)抗體生產(chǎn)的原材料制備、轉(zhuǎn)染和抗體生產(chǎn)等多個(gè)環(huán)節(jié)提供高通量的質(zhì)控解決方案。例如,靶向抗體的穩(wěn)定性和聚集性檢測(cè),我們一方面可以通過直接檢測(cè)抗體的自發(fā)熒光變化,研究尿素誘發(fā)的抗體變性過程[3],我們也可以利用ALPHA技術(shù),配合抗熱的、特異識(shí)別構(gòu)象表位的納米抗體開展抗體/蛋白復(fù)合物的熱穩(wěn)定性研究[4]。針對(duì)CHO等工具細(xì)胞株的一些重要污染指標(biāo),如dsRNA和HCP殘留等,我們則提供商業(yè)化的成熟解決方案[5,6]



左圖:該案例利用Envision多模式檢測(cè)平臺(tái),開展尿素誘發(fā)的抗體變性研究。通過檢測(cè)抗體自發(fā)熒光(280 nm ex/340 nm em)的變化,研究證明突變后抗體m01s5.4,在尿素壓力下的穩(wěn)定性要弱于m01s[3]. 右圖:基于AlphaLISA,研究使用EnVision多模式檢測(cè)平臺(tái)結(jié)合384-well OptiPlate孔板檢測(cè)疾病相關(guān)突變對(duì)γ-分泌酶穩(wěn)定性的影響[4]。

來源:上,|馳儀器有限公司
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標(biāo)簽: 微流控 蛋白電泳
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