熒光定量PCR實驗中常見問題及原因分析
熒光定量PCR 是PCR實驗中常見的PCR類型，下面歸納一下，客戶進(jìn)行PCR實驗時常遇見的一些問題。希望對具有PCR恐懼癥的伙伴們能有所幫助。
常見問題一： 熒光定量PCR的類型有幾種？有何區(qū)別？
答：目前熒光定量PCR實驗常用的方法主要有兩種，即：SYBR Green I染料法和Taqman探針法，兩者的主要區(qū)別在于：SYBR Green 染料的特點(diǎn)是只與DNA雙鏈相結(jié)合發(fā)出熒光，而當(dāng)熒光染料處在游離狀態(tài)時，不會發(fā)出熒光。所以在PCR循環(huán)體系中熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比例關(guān)系。染料法熒光定量的優(yōu)點(diǎn)是通用性比較強(qiáng)，幾乎適用于所有的熒光定量PCR反應(yīng)但也具有明顯非特異性。如果PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)引物二聚體或者進(jìn)行非特異性擴(kuò)增時，該染料也會這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合從而激發(fā)熒光，形成假陽性信號，對PCR定量結(jié)果一定的干擾，從而影響到PCR定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
常見問題二：熒光定量實驗中無擴(kuò)增曲線是什么原因?qū)е?/STRONG>？
答：一般來說，在熒光定量PCR實驗中，無擴(kuò)增曲線主要會有以下三種情況：
凝膠電泳時無條帶出現(xiàn)，無擴(kuò)增曲線。
這種情況需要考慮引物的設(shè)計是否合理？引物質(zhì)量是否正常？退火溫度設(shè)置是否合理？擴(kuò)增體系是否正常等等。
2.第二種情況比較容易出現(xiàn)的是在做電泳時會正常顯示條帶，但沒有明顯的擴(kuò)增曲線。這種情況有可能是探針合成過程出現(xiàn)問題；如果探針過程正常，則需要檢查探針淬火溫度、程序參數(shù)設(shè)定問題確排除后則可能是儀器故障導(dǎo)致。
3.另外，模板被降解或模板不足時也會出現(xiàn)無曲線擴(kuò)增現(xiàn)象。
常見問題三：熒光定量PCR時，有哪些需要注意的？
答：在進(jìn)行熒光定量PCR實驗室時，需要注意以下幾點(diǎn)：
1.PCR實驗室要有獨(dú)立的分區(qū)：一般PCR實驗室的樣品處理區(qū)、PCR反應(yīng)制備區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)，數(shù)據(jù)報告區(qū)等相互獨(dú)立使用放置DNA污染；
2.配置標(biāo)準(zhǔn)品的工具，包括移液器、吸頭等單獨(dú)使用一套工具，并且移液器的吸頭是帶濾芯的標(biāo)準(zhǔn)吸頭。
3.盡量不要用記號筆或標(biāo)簽在PCR管上做標(biāo)記，以免影響儀器的熒光檢測
4.PCR管或8排管使用完后，及時歸入在指定的廢棄放置區(qū)，不要與試驗區(qū)域內(nèi)的樣本混用。
5.每個步驟都需要做好防止DNA貨RNA污染措施。
