讓您的細(xì)胞高枕無(wú)憂的細(xì)胞房消毒方案
人為操作和環(huán)境我們大致可以從以下幾點(diǎn)進(jìn)行考察分析：
操作人員、細(xì)胞房、生物安全柜、顯微鏡置物臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、震動(dòng)、滅菌鍋。
人源污染及預(yù)防
人類(lèi)的皮膚總面積約2m2，存在約1012個(gè)微生物；我們1g的排遺物中約有1012個(gè)微生物。
-摘自上海高中生物第四冊(cè)第一章微生物
人源污染
那么我們?nèi)绾伪苊膺@些呢？接下來(lái)繼續(xù)探討~
1. 細(xì)胞房著裝要求操作細(xì)胞培養(yǎng)物前后應(yīng)洗手，穿戴個(gè)人防護(hù)設(shè)備不僅可保護(hù)您免受危險(xiǎn)品污染，還可降低皮屑以及衣服上污物和灰塵污染培養(yǎng)物的可能。
正確的穿衣順序：- ① 換專(zhuān)用鞋
- ② 無(wú)塵手套（避免不潔的雙手經(jīng)穿著時(shí)沾附于無(wú)塵衣上）
- ③ 網(wǎng)帽（帶網(wǎng)帽時(shí)須確保頭發(fā)不可暴露于網(wǎng)帽外，之后戴口罩遮住口鼻）
- ④ 無(wú)塵服（不要穿棉質(zhì)衣服(脫落纖維)）
- ⑤ 鞋套
德克龍(聚酯)
超凈工作臺(tái)或安全柜里的物品擺放一般遵循以下右手使用習(xí)慣，并可根據(jù)特殊實(shí)驗(yàn)中增加物品進(jìn)行相應(yīng)的改動(dòng)。
① 在工作臺(tái)中部開(kāi)闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器；② 移液器置于右前方易于取用的地方；
③ 試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸�。�
④ 試管架置于中后部，用于固定其他試劑；
⑤ 小型容器置于左后部，用于盛放廢液。
適合慣用右手的工作人員的工作臺(tái)基本布局。慣用左手的工作人員可相應(yīng)地調(diào)整工作臺(tái)面上物品的擺放位置。
-
- 小心取用無(wú)菌實(shí)驗(yàn)物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開(kāi)的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
-
- 每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同也不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以75%酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
-
- 離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標(biāo)記筆標(biāo)示內(nèi)容物名稱(chēng)、操作日期、操作人員姓名。若是細(xì)胞傳代培養(yǎng)，更需注明目前的代數(shù)，以及這是同一代中的第幾盤(pán)。
細(xì)胞房布局技巧
1. 細(xì)胞房功能分區(qū)
理想的無(wú)菌操作室應(yīng)劃分為三部分：
a) 更衣室---放在外，主要提供更換衣帽，鞋子，口罩，手套等。b）緩沖室---位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)和幾個(gè)操作間相通。目的是保證操作間的無(wú)菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。
c）操作室---放在內(nèi)間，分為無(wú)菌操作室、培養(yǎng)室、準(zhǔn)備室、清洗室、消毒滅菌室、儲(chǔ)存室。
房間設(shè)置要求：各個(gè)房間高度適宜（不超過(guò)2.5m），頂部過(guò)高會(huì)影響紫外線的滅菌效果；大小適當(dāng)，房間過(guò)大，清掃和消毒不便；過(guò)小，操作不便；墻壁應(yīng)光滑無(wú)死角，以便清洗和消毒。
2. 細(xì)胞房設(shè)計(jì)原則及條件
條件要求：封閉、正壓：隔離門(mén)和空調(diào)系統(tǒng)
溫濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)是37℃，飽和濕度；室內(nèi)是溫度18℃-26℃，濕度是45%-65%。潔凈度：空氣潔凈度等級(jí)是潔凈空間單位體積空氣中，以大于或等于被考慮粒徑的離子最大濃度限值進(jìn)行劃分的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。潔凈度等級(jí)應(yīng)在空態(tài)、靜態(tài)和動(dòng)態(tài)放大進(jìn)行測(cè)試，使用塵埃粒子測(cè)試儀來(lái)測(cè)定。
3. 細(xì)胞房布局原則
摘自：《Culture of Animal Cells》
細(xì)胞房維護(hù)保養(yǎng)：
1. 每天檢查并記錄細(xì)胞房溫度、相對(duì)濕度（細(xì)胞房溫濕度記錄表)，發(fā)現(xiàn)異常要及時(shí)報(bào)告并處理。2. 生物安全柜或超凈臺(tái)維護(hù)：每年委托有資質(zhì)第三方對(duì)生物安全柜或超凈臺(tái)進(jìn)行風(fēng)速、氣流流型、高效測(cè)漏、塵埃粒子、沉降菌的檢測(cè)。
日常維護(hù)：定期對(duì)生物安全柜或超凈臺(tái)進(jìn)行塵埃粒子、沉降菌或浮游菌的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)不合格及時(shí)更換濾網(wǎng)或進(jìn)行維修。
3. 空調(diào)系統(tǒng)維護(hù): 定時(shí)更換初中效過(guò)濾器，每年請(qǐng)有資質(zhì)第三方對(duì)潔凈室進(jìn)行塵埃粒子、沉降菌或浮游菌、換氣次數(shù)、高效測(cè)漏、壓差等檢測(cè)。
日常維護(hù)：按照要求定期監(jiān)測(cè)塵埃粒子、沉降菌或浮游菌。
細(xì)胞房消毒方法
1. 細(xì)胞培養(yǎng)箱防菌試劑
Pharmacidal （IC-110100）
主要成分：Pharmacidal 是由篩選過(guò)的有機(jī)氮化合物組成，主要組成成分為：芐基二甲基辛基氯化銨、芐索氯銨、三羥乙基胺，并添加丙二醇等清潔消毒劑。作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂質(zhì)變性，分解細(xì)胞膜的雙層磷脂質(zhì)和增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致酶的滅活，蛋白質(zhì)沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)。
特點(diǎn)： Pharmacidal 對(duì)大部分的細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
使用方法：
-
可消毒橡膠手套、超凈臺(tái)面、桌面、顯微鏡臺(tái)、試劑瓶身等物體表面，噴涂完全濕潤(rùn)，不需擦拭，自然風(fēng)干。
-
培養(yǎng)箱內(nèi)壁噴涂完全濕潤(rùn)后，等待10分鐘后，用無(wú)菌吸水紙吸干內(nèi)壁上的殘留液體。
2. 水浴鍋、水盤(pán)防菌試劑
Aquaguard-1 Aquaguard-2
貨號(hào)：01-867-1B 貨號(hào)：01-916-1B
主要成分：苯甲酸鈉 主要成分：2-溴代-2-硝基-1,3-丙二醇
用來(lái)消毒培養(yǎng)箱中的水盤(pán)，可有效殺滅細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無(wú)毒；對(duì)不銹鋼無(wú)腐蝕性；不揮發(fā)。
用法：
1. 建議每?jī)芍苓M(jìn)行一次系統(tǒng)的清潔和消毒培養(yǎng)箱。
Aquaguard-2
用來(lái)消毒水浴鍋，可有效殺滅細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建議每周進(jìn)行一次系統(tǒng)的清潔和消毒水浴鍋。
2. 稀釋500倍即可使用，即將1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。
3. 超凈臺(tái)、桌面、試劑瓶身消毒方案
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滅菌方法 |
作用原理 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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Pharmacidal 噴壺
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季銨鹽作用方式是使脂質(zhì)變性。分解細(xì)胞膜的雙層磷脂和增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致酶失活，蛋白沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)，可有效防止真菌、細(xì)菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生長(zhǎng)。 |
滅菌徹底；無(wú)毒無(wú) 害；無(wú)刺激性；無(wú) 腐蝕性；可生物降 解 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會(huì)抵消其作用。 |
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酒精 |
乙醇的抗菌原理是使蛋白質(zhì)變性 |
高效滅菌；價(jià)格 實(shí)惠 |
易揮發(fā)，作用時(shí)間短；有刺激性；易燃 |
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新潔爾滅 （苯扎溴銨） |
季銨鹽類(lèi)消毒劑屬于陽(yáng)離子表面活性劑，能吸附帶陰離子的細(xì)菌并破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，增加細(xì)菌胞漿膜通透性, 使菌體胞漿物質(zhì)外滲,阻礙其代謝而起到殺滅作用。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、 真菌；刺激性低； 無(wú)腐蝕 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會(huì)抵消其作用。 |
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來(lái)蘇爾
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酚類(lèi)可裂解并穿透細(xì)胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺 滅細(xì)胞。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、 真菌 |
刺激性強(qiáng)，易使橡膠制品變脆變硬 |
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滴露 |
酚類(lèi)可裂解并穿透細(xì)胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺 滅細(xì)胞。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、 真菌 |
刺激性強(qiáng)，易使橡膠制品變脆變硬 |
4. 細(xì)胞房空氣消毒方案
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滅菌方法 |
作用原理 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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紫外線燈殺菌 |
波長(zhǎng)在220-300nm的紫外線稱(chēng)為“殺生命區(qū)”，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。紫外線作用于細(xì)胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。 |
能有效殺滅常見(jiàn)的微生 物如金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌 |
穿透力差；有死角；與被照物的距離以不超過(guò)1.2m為宜；致癌 |
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甲醛 熏蒸 |
它能與蛋白質(zhì)中的氨基酸結(jié)合而使蛋白變性，使酶的活性消失。 |
滅菌徹底；不易燃、 不爆炸，不腐蝕金屬 |
殘留性大；致癌 |
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過(guò)氧化氫 干霧滅菌 |
通過(guò)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)解離具有高活性的羥基作用于細(xì)胞膜，其強(qiáng)氧化性破壞組成細(xì)菌的蛋白質(zhì)，使之死亡。 |
滅菌徹底；殘留性小 |
有腐蝕；易爆；致癌 |
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臭氧滅菌 |
高壓電場(chǎng)使電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊，導(dǎo)致空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧不穩(wěn)定，很快自行分解成氧氣（O2）和單個(gè)氧原子（O）；后者具有很強(qiáng)的活性，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠氧原子的彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的。 |
滅菌徹底；殘留性小 |
費(fèi)用較為昂貴 |
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空氣過(guò)濾 （恒溫恒濕裝置） |
逐次使用不同孔徑的濾膜將微生物過(guò)濾干凈 |
除菌效果高；無(wú)毒 |
費(fèi)用較為昂貴 |
5. 細(xì)胞房地面消毒方案
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滅菌劑 |
作用原理 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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Pharmacidal 噴壺 |
季銨鹽作用方式是使脂質(zhì)變性。分解細(xì)胞膜的雙層磷脂和增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致酶失活，蛋白沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)，可有效防止真菌、細(xì)菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生長(zhǎng)。 |
滅菌徹底；無(wú)毒無(wú)害；無(wú)刺激性；無(wú)腐蝕性；可生物降解 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會(huì)抵消其作用。 |
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84消毒液
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84消毒殺菌最主要的作用方式是通過(guò)它的水解作用形成次氯酸，次氯酸再進(jìn)一步分解形成新生態(tài)氧[O]，新生態(tài)氧的極強(qiáng)氧化性使菌體和病毒的蛋白質(zhì)變性，從而使病原微生物致死。 |
滅菌徹底；殘留性�。粌r(jià)格便宜 |
有腐蝕 |
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新潔爾滅 （苯扎溴銨） |
季銨鹽類(lèi)消毒劑屬于陽(yáng)離子表面活性劑，能吸附帶陰離子的細(xì)菌并破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，增加細(xì)菌胞漿膜通透性, 使菌體胞漿物質(zhì)外滲,阻礙其代謝而起到殺滅作用。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、真菌；刺激性低；無(wú)腐蝕 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會(huì)抵消其作用。 |
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來(lái)蘇爾
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酚類(lèi)可裂解并穿透細(xì)胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺滅細(xì)胞。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、真菌 |
刺激性強(qiáng)，易使橡膠制品變脆變硬 |
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滴露 |
酚類(lèi)可裂解并穿透細(xì)胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺滅細(xì)胞。 |
可殺滅常見(jiàn)細(xì)菌、真菌 |
刺激性強(qiáng)，易使橡膠制品變脆變硬 |
細(xì)胞污染殺除試劑
細(xì)菌克星-抗生素
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貨號(hào) |
抗生素 |
作用對(duì)象 |
使用比例 |
儲(chǔ)存條件 |
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03-049-1B |
卡那霉素溶液（10mg/ml） |
細(xì)菌（如G+、G-、支原體） |
稀釋:1:100 |
-20ºC |
|
03-035-1B |
硫酸慶大霉素溶液（50 mg/ml） |
細(xì)菌（如G+、G-、支原體） |
稀釋: 1:1000 |
AMB室溫 |
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03-031-1B |
青鏈雙抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate） |
細(xì)菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
|
03-031-5B |
青鏈雙抗，10濃縮液（10X Conc., 100,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 100mg/ml, Streptomycin Sulfate） |
細(xì)菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:1000 |
-20ºC |
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03-032-1B |
青鏈霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin） |
細(xì)菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
|
03-033-1B |
青鏈霉素，兩性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B） |
細(xì)菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
|
03-034-1B |
青鏈霉素，新霉素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25mg/ml Neomycin Sulfate） |
細(xì)菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
真菌克星-抗生素
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貨號(hào) |
抗生素 |
作用對(duì)象 |
使用比例 |
儲(chǔ)存條件 |
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03-029-1B |
兩性霉素（2500ug/ml） |
真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:1000 ~ 1: 10,000 |
-20ºC |
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03-030-1C |
制霉菌素（10,000units/ml） |
真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:100 to 1:1000 |
-20ºC |
|
03-032-1B |
青鏈霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin） |
細(xì)菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
|
03-033-1B |
青鏈霉素，兩性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B） |
細(xì)菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
支原體檢測(cè)試劑
支原體檢測(cè)試劑盒的特異性：
引物與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并檢測(cè)16S，rRNA靶區(qū)同源性。96種支原體具有相關(guān)序列同源性。
支原體殺除試劑
BIOMYC-1（貨號(hào)：03-036-1B）、BIOMYC-2（貨號(hào)：03-037-1B）、BIOMYC-3（貨號(hào)03-038-1B）
方案一：
BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）的使用方法：
1. 加 1ml的 BIOMYC-1 溶液至 100ml培養(yǎng)基中，保持受污染的細(xì)胞在混合液中培養(yǎng) 4 天。期間需加入含 BIOMYC-1 溶液的少許的新培養(yǎng)基；
2. 4天后，加1ml BIOMYC-2 溶液至 100ml 的新培養(yǎng)基中，并維持培養(yǎng) 3 天；
3. 以上是一個(gè)處理循環(huán)階段，可繼續(xù)2-3次如上處理循環(huán)。
4. 在處理過(guò)程中，細(xì)胞需要做支原體污染檢測(cè)，以確認(rèn)效果，從而適當(dāng)減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
方案二：
BIOMYC-3（03-038-1B）的使用方法：
1. 加1ml BIOMYC-3至100ml培養(yǎng)基中；
2. 持續(xù)培養(yǎng)14天，期間每2-3天更換一次含BIOMYC-3培養(yǎng)基;
3. 14天后，用不含BIOMYC-3的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞14天后再做支原體檢測(cè)。
經(jīng)濟(jì)考慮，用戶(hù)選擇一種方案即可；最佳方案是，客戶(hù)先用方案一處理一周期，再用方案二處理一周期。
友情提示：如果使用其中一種方案，不能根除支原體，說(shuō)明該支原體可能在另一種方案的抑菌譜內(nèi)；36，37，38三者聯(lián)合可有效根除實(shí)驗(yàn)室95%以上的支原體污染。
黑膠蟲(chóng)殺除試劑
BIOMYC-1（03-036-1B）、BIOMYC-2（03-037-1B）、BIOMYC-3（03-038-1B）
三抗 03-033-1B（主要成分：青、鏈、兩性霉素。）
黑膠蟲(chóng)殺除方案一：
BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
- 加1ml的 BIOMYC-1和三抗溶液至100ml培養(yǎng)基中，保持受污染的細(xì)胞在混合液中培養(yǎng)4天。期間需加入含BIOMYC-1和三抗溶液的少許的新培養(yǎng)基；
- 4天后，加1mlBIOMYC-2和三抗溶液至100ml的新培養(yǎng)基中，并維持培養(yǎng) 3天；
- 以上是一個(gè)處理循環(huán)階段，必要時(shí)可繼續(xù)2-3次如上處理循環(huán)。
- 在處理過(guò)程中，細(xì)胞需要做支原體污染檢測(cè)，以確認(rèn)效果，從而適當(dāng)減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
BIOMYC-3（03-038-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
- 加1mlBIOMYC-3和三抗溶液至100ml培養(yǎng)基中；
- 持續(xù)培養(yǎng)14天，期間每2-3天更換一次培養(yǎng)基;
- 14天后，用不含BIOMYC-3和三抗溶液的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞14天后再做支原體檢測(cè)。
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