mRNA-LNP處方疫苗的分子組成結(jié)構(gòu)解析
mRNA-LNP無疑是近兩年最火熱的研究熱點，隨著新冠疫情的不斷肆虐，幾款采用了mRNA-LNP的新冠疫苗陸續(xù)上市，使人們對這一具有廣泛應用前景的技術(shù)愈發(fā)重視。那么對于一個制備良好的mRNA-LNP，其內(nèi)部分子組成結(jié)構(gòu)到底是怎樣的呢？今天小編就通過相關(guān)研究帶大家一起探索其組成結(jié)構(gòu)。
首先，目前普遍采用的mRNA-LNP處方多是通過由陽離子磷脂、DSPC（二硬脂酰磷脂酰膽堿）、膽固醇、DMPE-PEG2000（磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）構(gòu)建的LNP來實現(xiàn)對mRNA分子的包載。幾種磷脂分子發(fā)揮各自的功效將mRNA分子包裹在內(nèi)部形成一個球形的脂質(zhì)納米粒，而且通過處方的調(diào)整，也可以實現(xiàn)粒徑大小不同的LNP制備，詳見圖1電鏡圖。
圖1. LNP的冷凍透射電鏡圖，a、b、c分別為粒徑大小在48nm、64nm、100nm左右的LNP
隨后采用小角中子散射技術(shù)來進一步研究LNP上的磷脂分子分布情況，利用氘化的DSPC和膽固醇進行LNP的制備，并分別在不同比例下的D2O/H2O緩沖液中檢測其散射信號。結(jié)果如圖2A，散射信號只在緩沖液中D2O較低時檢測到，即在q ∼ 1 nm−1處有一明顯的峰。而DSPC的散射長度密度（SLD）和其他磷脂材料有最大的區(qū)別，這些散射曲線都與之前報道過的核-殼結(jié)構(gòu)體系的小角散射的結(jié)果相似，而且圖中的數(shù)據(jù)擬合與一核兩層殼的結(jié)構(gòu)最為吻合。圖2B中的散射長度密度數(shù)據(jù)則可代表LNP外殼到中心的距離，圖2C則是根據(jù)散射結(jié)果分析后得到的LNP結(jié)構(gòu)的模型示意圖。在此模型中，我們認為LNP的核由陽離子磷脂、膽固醇、mRNA和水組成，在此核的外部是一層2.4 nm厚的由DSPC，少部分的陽離子磷脂、膽固醇以及PEG磷脂中的DMPE端組成的單層殼。再向外則是一層約4 nm厚的PEG磷脂殼。
圖2. (A)不同D2O含量下的LNP小角中子散射結(jié)果，從上至下分別為18%、27%、50%、68%、100%的D2O。(B) SLD曲線作為LNP中心距離的函數(shù)，與A中數(shù)據(jù)的擬合相對應。(C) 根據(jù)SLD數(shù)據(jù)描繪的LNP中脂質(zhì)分布示意圖
同時，根據(jù)LNP主要成分的SLD數(shù)據(jù)，詳見表1，可以詳細驗證LNP系統(tǒng)的組成。溶劑的SLD由H2O/D2O的比例給出，PEG層的SLD隨著它延伸到溶劑中而變化。在LNP中，內(nèi)核的SLD是恒定的，但隨著D2O含量的變化而變化。mRNA的SLD也隨著D2O體積分數(shù)的增加而增加，因為它含有可以交換為氘的不穩(wěn)定氫。利用擬合的內(nèi)核SLD值作為D2O含量的函數(shù)，以及LNP組分已知的SLD值(表1)與建立的脂質(zhì):mRNA摩爾比，根據(jù)以下公式可以計算LNP中的水含量。其中V是各成分的體積分數(shù)。
目前這一mRNA-LNP的結(jié)構(gòu)也是目前比較公認的一種結(jié)構(gòu)，但是通過相關(guān)研究可以進一步為我們提供強有力的科研依據(jù)。幾種脂質(zhì)成分不是均勻的隨意分布在LNP上的，其結(jié)構(gòu)信息也會給研究者們提供更多的靈感，以幫助他們設計研發(fā)更加合理有效的mRNA-LNP出來。
首先，目前普遍采用的mRNA-LNP處方多是通過由陽離子磷脂、DSPC（二硬脂酰磷脂酰膽堿）、膽固醇、DMPE-PEG2000（磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）構(gòu)建的LNP來實現(xiàn)對mRNA分子的包載。幾種磷脂分子發(fā)揮各自的功效將mRNA分子包裹在內(nèi)部形成一個球形的脂質(zhì)納米粒，而且通過處方的調(diào)整，也可以實現(xiàn)粒徑大小不同的LNP制備，詳見圖1電鏡圖。
圖1. LNP的冷凍透射電鏡圖，a、b、c分別為粒徑大小在48nm、64nm、100nm左右的LNP
隨后采用小角中子散射技術(shù)來進一步研究LNP上的磷脂分子分布情況，利用氘化的DSPC和膽固醇進行LNP的制備，并分別在不同比例下的D2O/H2O緩沖液中檢測其散射信號。結(jié)果如圖2A，散射信號只在緩沖液中D2O較低時檢測到，即在q ∼ 1 nm−1處有一明顯的峰。而DSPC的散射長度密度（SLD）和其他磷脂材料有最大的區(qū)別，這些散射曲線都與之前報道過的核-殼結(jié)構(gòu)體系的小角散射的結(jié)果相似，而且圖中的數(shù)據(jù)擬合與一核兩層殼的結(jié)構(gòu)最為吻合。圖2B中的散射長度密度數(shù)據(jù)則可代表LNP外殼到中心的距離，圖2C則是根據(jù)散射結(jié)果分析后得到的LNP結(jié)構(gòu)的模型示意圖。在此模型中，我們認為LNP的核由陽離子磷脂、膽固醇、mRNA和水組成，在此核的外部是一層2.4 nm厚的由DSPC，少部分的陽離子磷脂、膽固醇以及PEG磷脂中的DMPE端組成的單層殼。再向外則是一層約4 nm厚的PEG磷脂殼。
圖2. (A)不同D2O含量下的LNP小角中子散射結(jié)果，從上至下分別為18%、27%、50%、68%、100%的D2O。(B) SLD曲線作為LNP中心距離的函數(shù)，與A中數(shù)據(jù)的擬合相對應。(C) 根據(jù)SLD數(shù)據(jù)描繪的LNP中脂質(zhì)分布示意圖
同時，根據(jù)LNP主要成分的SLD數(shù)據(jù)，詳見表1，可以詳細驗證LNP系統(tǒng)的組成。溶劑的SLD由H2O/D2O的比例給出，PEG層的SLD隨著它延伸到溶劑中而變化。在LNP中，內(nèi)核的SLD是恒定的，但隨著D2O含量的變化而變化。mRNA的SLD也隨著D2O體積分數(shù)的增加而增加，因為它含有可以交換為氘的不穩(wěn)定氫。利用擬合的內(nèi)核SLD值作為D2O含量的函數(shù)，以及LNP組分已知的SLD值(表1)與建立的脂質(zhì):mRNA摩爾比，根據(jù)以下公式可以計算LNP中的水含量。其中V是各成分的體積分數(shù)。
VDLin-MC3-DMA · SLDDLin-MC3-DMA + VChol · SLDChol+ VH2O · SLDH2O +VRNA · SLDRNA =SLDcore
目前這一mRNA-LNP的結(jié)構(gòu)也是目前比較公認的一種結(jié)構(gòu)，但是通過相關(guān)研究可以進一步為我們提供強有力的科研依據(jù)。幾種脂質(zhì)成分不是均勻的隨意分布在LNP上的，其結(jié)構(gòu)信息也會給研究者們提供更多的靈感，以幫助他們設計研發(fā)更加合理有效的mRNA-LNP出來。
參考文獻：
1. Zackrisson M, et al. (2005) Small-angle neutron scattering on a core-shell colloidal system: A contrast-variation study. Langmuir 21:10835–10845
2. Belliveau NM, et al. (2012) Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids 1:e37.
3. Marianna YA, et al.（2018）Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. PNAS 115: E3351–E3360
應用范圍：
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