復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科陳世益教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日在生物材料領(lǐng)域頂尖期刊《Biomaterials》（IF = 10.317）上發(fā)表文章，證明了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在促進(jìn)腱-骨愈合上具有積極作用。



肩袖撕裂是一種常見的運(yùn)動(dòng)損傷，威脅著專業(yè)運(yùn)動(dòng)員及廣大運(yùn)動(dòng)愛好者的健康。醫(yī)生大多采用肩袖修復(fù)術(shù)將撕裂的肌腱重新固定在骨表面。大多數(shù)患者能夠獲得良好的效果，但有些患者會(huì)發(fā)生再次撕裂。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是止點(diǎn)（enthesis）無法快速再生腱-骨界面的結(jié)構(gòu)。止點(diǎn)是肌腱或韌帶附著于骨頭的部位。

基于再生醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞治療有望為肩袖損傷提供新的治療手段。人們已采用不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來促進(jìn)腱-骨愈合，并在實(shí)驗(yàn)中獲得了成功。然而，引入外源性材料也存在風(fēng)險(xiǎn)。植入的干細(xì)胞可能具有致瘤性，這限制了臨床應(yīng)用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，真正有效的是干細(xì)胞的分泌組（secretome），而間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含了干細(xì)胞分泌的所有營(yíng)養(yǎng)因子。

基于此，研究人員收集了人類骨髓來源干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（hBMSC-CM），并檢測(cè)了這種無細(xì)胞方法是否能夠在大鼠肩袖修復(fù)模型中促進(jìn)腱-骨愈合。為了確保培養(yǎng)基在腱-骨界面處局部釋放，他們將小塊的海綿浸泡在培養(yǎng)基中，然后植入肩袖修復(fù)處。之后，他們利用相關(guān)細(xì)胞系在體外驗(yàn)證了觀察到的結(jié)果，并在體內(nèi)進(jìn)一步研究了hBMSC-CM介導(dǎo)的腱-骨愈合作用（圖1）。
 

圖1. 研究技術(shù)路線圖

hBMSC-CM促進(jìn)了大鼠肩袖處的腱-骨愈合

研究人員首先利用賽業(yè)的間充質(zhì)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基，對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。他們接著收集了間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，測(cè)定了幾種生長(zhǎng)因子的濃度。他們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中含有TGF-β、VEGF和IGF-1等能夠促進(jìn)腱-骨愈合的生長(zhǎng)因子。

之后，他們將海綿切成1mg的小塊，在滅菌后放入hBMSC-CM中浸泡30分鐘，并植入大鼠的肩袖修復(fù)處。術(shù)后4周和8周，他們通過組織學(xué)和放射學(xué)方法觀察到了再生的止點(diǎn)（圖2）。Micro-CT顯示，CM組修復(fù)區(qū)域的骨密度顯著高于DMEM對(duì)照組。

由于成纖維細(xì)胞是腱-骨止點(diǎn)重建的主要參與者，他們還檢測(cè)了腱-骨界面處的α-SMA連續(xù)表達(dá)。根據(jù)免疫組化染色分析，兩組患者主要在術(shù)后2周表達(dá)α-SMA。定量分析結(jié)果表明，CM組的陽性面積顯著高于DMEM組，表明CM組的重建過程更為活躍。這些結(jié)果顯示，hBMSC-CM可提高再生止點(diǎn)的質(zhì)量，促進(jìn)腱-骨愈合。
 

圖2. 肩袖修復(fù)后再生止點(diǎn)的組織學(xué)和放射學(xué)分析

hBMSC-CM的積極作用與巨噬細(xì)胞有關(guān)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，海綿的完全降解期約為2周，與炎癥期重疊。在炎癥發(fā)生期間，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在腱-骨界面。于是，研究人員分析了hBMSC-CM是否在體內(nèi)和體外影響巨噬細(xì)胞的表型。免疫組化結(jié)果顯示，術(shù)后2周，CM組的CD86（M1表型標(biāo)志物）水平顯著低于DMEM組，而CD163（M2表型標(biāo)志物）水平顯著高于DMEM組，表明hBMSC-CM能夠抑制M1表型并促進(jìn)M2表型（圖3）。

與表型變化一致，促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1α和 IL-1β）和抗炎細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10和IL-13）的濃度也發(fā)生了變化。在LPS刺激后，促炎細(xì)胞因子的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著升高，而抗炎細(xì)胞因子的mRNA水平?jīng)]有顯著變化。不過，hBMSC-CM的干預(yù)下調(diào)了促炎細(xì)胞因子的水平，而增強(qiáng)了抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)。
 

圖3. hBMSC-CM對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響

那么，hBMSC-CM對(duì)體內(nèi)腱-骨愈合的積極作用是否取決于巨噬細(xì)胞的存在？為了解答這個(gè)問題，研究人員使用了巨噬細(xì)胞清除（MC）大鼠，并觀察了hBMSC-CM對(duì)MC大鼠肩袖腱-骨愈合的影響。通過組織學(xué)和生物力學(xué)分析，他們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞清除可促進(jìn)大鼠肩袖的腱-骨愈合，但在沒有巨噬細(xì)胞的情況下，hBMSC-CM失去了其優(yōu)勢(shì)，表明hBMSC-CM對(duì)腱-骨愈合的積極作用依賴于巨噬細(xì)胞。

hBMSC-CM通過Smad2/3通路
調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化

最后，研究人員探索了hBMSC-CM調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。在LPS刺激后，hBMSC-CM能夠顯著升高Smad2/3的磷酸化水平，而抑制劑SB431542有效抑制了Smad2/3磷酸化。同時(shí)，SB431542顯著逆轉(zhuǎn)了hBMSC-CM對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。當(dāng)Smad2/3激活被SB431542阻斷后，hBMSC-CM對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制作用和對(duì)抗炎細(xì)胞因子的促進(jìn)作用也被消除。這一現(xiàn)象表明，在炎性環(huán)境下，Smad2/3信號(hào)通路參與了hBMSC-CM對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。

基于這些結(jié)果，研究人員認(rèn)為hBMSC-CM通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化并抑制M1表型，促進(jìn)了大鼠模型肩袖處的腱-骨愈合。在hBMSC-CM的刺激下，成纖維細(xì)胞在腱-骨界面處積累，伴隨著纖維軟骨（fibrocartilage）的更早形成以及數(shù)量更多。再生的止點(diǎn)不僅更加有序，而且具有更好的生物力學(xué)性能（圖4）。考慮到無細(xì)胞hBMSC-CM的安全性，研究人員認(rèn)為它有望應(yīng)用于臨床來促進(jìn)腱-骨愈合。
 

圖4. 大鼠肩袖修復(fù)后的腱-骨愈合示意圖

原文檢索：
Chen W, Sun Y, Gu X, Cai J, Liu X, Zhang X, Chen J, Hao Y, Chen S. Conditioned medium of human bone marrow-derived stem cells promotes tendon-bone healing of the rotator cuff in a rat model. Biomaterials. 2021 Feb 11;271:120714. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120714. Epub ahead of print. PMID: 33610048.