研究背景：
由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的2019新冠肺炎(COVID-19)在全球范圍內(nèi)爆發(fā)，已感染超8500萬(wàn)人，導(dǎo)致超過(guò)180萬(wàn)人死亡，發(fā)熱、咳嗽、肌痛或疲勞是COVID-19患者的常見(jiàn)癥狀。一旦病情惡化，急性呼吸窘迫綜合征、呼吸衰竭、敗血癥和急性腎損傷是常見(jiàn)的致命并發(fā)癥。全球COVID-19大流行的持續(xù)發(fā)展，需要開(kāi)發(fā)針對(duì)SARS-CoV-2的治療方法。

2021年3月18日，中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)放射損傷及放射復(fù)合傷的發(fā)病機(jī)制與防治研究團(tuán)隊(duì)合作在ACS NANO雜志（IF=15.498）發(fā)表了題為“Membrane Nanoparticles Derived from ACE2- Rich Cells Block SARS-CoV-2 Infection”的研究論文。
 

王成副教授，王少博，陳銀為第一作者，趙景宏教授、王軍平教授為通訊作者，開(kāi)發(fā)出了一種由富含ACE2的細(xì)胞膜制成的納米粒子，可以阻止SARS-CoV-2的刺突，從而阻止感染。

該研究發(fā)現(xiàn)了針對(duì)2019冠狀病毒病(COVID-19)SARS-CoV-2的治療方法。病毒致病過(guò)程包括細(xì)胞聯(lián)合、膜穿透、內(nèi)體逃逸、病毒粒子脫殼和基因組復(fù)制，致病機(jī)理SARS-CoV-2附著在細(xì)胞膜上是COVID-19發(fā)病的第一步。這一過(guò)程可歸因于病毒spike (S)蛋白，該蛋白可被蛋白酶降解為S1和S2亞基。S1負(fù)責(zé)識(shí)別宿主受體，S2介導(dǎo)病毒融合進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。ACE2是SARS-CoV-2 S1的主要受體，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)，從富含ACE2的細(xì)胞中制備的納米膜顆粒(NPs)具有有效阻斷SARS-CoV-2感染的能力。以高表達(dá)ACE2的人胚腎239t細(xì)胞膜為材料，采用擠壓法制備NPs。這些被稱為ACE2- NPs的納米材料表面含有265.1 ng/mg ACE2，并以劑量依賴的方式作為誘捕新冠病毒（S1蛋白）的誘餌，導(dǎo)致HK-2人腎小管上皮細(xì)胞中病毒配體的招募減少。除了影響受體的識(shí)別，S1移位到細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)減少視神經(jīng)萎縮的表達(dá)和增加細(xì)胞色素c的釋放來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ACE2-NPs也抑制了這一作用。進(jìn)一步研究表明，ACE2-NPs能有效抑制SARS-CoV-2假病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在體內(nèi)外阻斷病毒感染。本研究確定ACE2-NPs膜納米是SARS-CoV-2的拮抗劑，豐富了現(xiàn)有的抗病毒藥物庫(kù)，為COVID-19的治療提供了可能性。
 

圖1. ACE2-NPs的制備及功能示意圖

研究結(jié)果
1.ACE2-NPs的制備與鑒定
通過(guò)Western blotting分析人類細(xì)胞系(包括HEK-293T細(xì)胞、HEK-293T-ACE2細(xì)胞、HK-2近端小管細(xì)胞、Caco-2腸上皮細(xì)胞和A549 II型肺細(xì)胞)中的ACE2水平。HEK-293T-ACE2在攜帶病毒受體方面優(yōu)于其他細(xì)胞系(圖2a)。與ACE2在腸上皮細(xì)胞中的位置一致，ACE2多位于HEK-293T-ACE2細(xì)胞的細(xì)胞膜上(圖2b)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)冷凍和解凍以分離膜，再用超聲破碎膜，然后用擠壓方法制備ACE2-NPs。制備的NPs攜帶ACE2，不含殘留的核酸(圖2c)。透射電鏡(TEM)顯示，與使用相同尺寸的聚碳酸酯膜制備的紅細(xì)胞衍生NPs一樣，ACE2-NPs的尺寸約為100 nm，在溶液中具有較好的分散性(圖2d)。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)到，帶負(fù)電荷的納米材料的平均直徑為169 nm(圖2e)。采用相同方法制備的HEK-293T衍生NPs (293T-NPs)的ACE2含量低于ACE2-NPs(圖2f、2g)，這是進(jìn)一步功能評(píng)估的先決條件。

圖2. ACE2在人體細(xì)胞中的篩選及ACE2-NPs的鑒定

 

2.ACE2-NPs對(duì)S1募集到敏感細(xì)胞的抑制作用
S1包含一個(gè)受體結(jié)合域(RBD)，是ACE2的配體。我們將生物素修飾的RBD固定在鏈霉親和素(SA)生物傳感器上，并通過(guò)BLI測(cè)定其與NPs的相互作用。在相同濃度下，ACE2-NPs結(jié)合RBD多于293T-NPs(圖3a)。隨著S1附著在敏感細(xì)胞的表面，我們將細(xì)胞與10 μg/mL S1一起培養(yǎng)，無(wú)論有無(wú)NPs，ACE2-NPs顯著減少了對(duì)S1的募集(基于膜蛋白)，并且比293T-NPs更有效(圖3b)。ACE2-NPs以劑量依賴的方式與RBD結(jié)合(圖3a)，與劑量依賴的S1一致。免疫熒光顯示S1吸附在ACE2-NPs上(圖2c)。因此，ACE2-NPs處理后，HK-2細(xì)胞粘附的S1亞基較少(圖3c)。隨著病毒突變，一種由Gly (D614G)取代Asp⁶¹⁴的S1變異在全球流行。這種突變SARS-CoV-2比野生型更具傳染性。數(shù)據(jù)顯示，D614G-S1與ACE2的親和力為11.6 nM(圖3d)，與野生型S1與ACE2的親和力相當(dāng)(8.02 nM)。也就是說(shuō)D614G突變病毒比祖先型更強(qiáng)的傳染性不是由于受體的增強(qiáng)。D614G突變沒(méi)有改變ACE2-NPs與S1的劑量依賴結(jié)合。ACE2-NPs仍然與D614G-S1結(jié)合和阻斷D614G-S1的募集(圖3e)時(shí)，比293T-NPs更有效。
 

圖3. ACE2-NPs對(duì)S1招募的抑制作用

3.ACE2-NPs對(duì)S1誘導(dǎo)凋亡的抑制作用
S1位于HK-2的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(圖3c)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，SARS-CoV-2的單個(gè)蛋白質(zhì)重塑宿主細(xì)胞的中心通路，導(dǎo)致代謝紊亂，包括線粒體功能障礙。SARS-CoV-2 S1可能影響受體識(shí)別功能以外的細(xì)胞代謝。通過(guò)基因(GO)分析確定線粒體組織和凋亡信號(hào)通路被富集(圖4a)。線粒體組織的動(dòng)態(tài)改變與細(xì)胞凋亡相關(guān)。OPA1是一種位于線粒體內(nèi)膜的動(dòng)力相關(guān)蛋白，它通過(guò)嵴重構(gòu)而不依賴于線粒體融合來(lái)控制細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)OPA1通過(guò)抑制細(xì)胞色素c的釋放和依賴細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活來(lái)保護(hù)細(xì)胞避免凋亡。Western blotting(圖4b)和RT-PCR反應(yīng)(圖4c,d)顯示，S1和D614G-S1刺激都降低了OPA1的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞色素c的釋放和細(xì)胞凋亡蛋白酶3的激活。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)S1和D614G-S1顯著增加了HK-2細(xì)胞的凋亡(圖4e)。ACE2-NPs處理可提高細(xì)胞OPA1水平，以劑量依賴的方式減少S1和D614G-S1引起的細(xì)胞凋亡。根據(jù)S1招募的差異，ACE2-NPs在抑制細(xì)胞凋亡方面優(yōu)于293T-NPs。
 

圖4. ACE2-NPs對(duì)s1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用

 

4.ACE2-NPs的抗病毒作用
為了深入了解ACE2-NPs體外抗病毒特性，我們用含有熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的SARS-CoV-2S假病毒感染HK-2細(xì)胞。SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合，通過(guò)跨膜蛋白酶絲氨酸2在S1/S2邊界的蛋白水解進(jìn)入宿主細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)原蛋白轉(zhuǎn)化酶也通過(guò)預(yù)激活病毒S蛋白促進(jìn)SARS-CoV-2進(jìn)入宿主。S假病毒在共孵育1小時(shí)后被HK-2細(xì)胞大量?jī)?nèi)吞(圖5a)。ACE2-和293T-NP治療均減少了病毒進(jìn)入細(xì)胞。透射電鏡顯示，S假病毒被吸附在ACE2和293T-NPs上(圖5b)，形成類冠狀病毒復(fù)合物。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示ACE2-NPs具有劑量依賴性的抗病毒活性(圖5c)。ACE2-NPs的半數(shù)抑制濃度(IC50)低于293T-NPs (圖5d)。
 

圖5. ACE2-NPs的抗病毒活性評(píng)價(jià)

 

5.小鼠感染模型NPs的體內(nèi)抗病毒特性
為了評(píng)估假病毒的小鼠感染模型NPs的體內(nèi)抗病毒特性，將帶有flag標(biāo)記的ACE2腺病毒靜脈注射給C57小鼠;然后給小鼠注射表達(dá)帶有His-tag和NPs的綠色熒光蛋白的S假病毒顆粒(圖6a)。被腺病毒感染的小鼠產(chǎn)生ACE2-Flag，導(dǎo)致對(duì)S假病毒敏感(圖6b)。通過(guò)檢測(cè)EGFP和His-tag驗(yàn)證假病毒的感染情況。我們發(fā)現(xiàn)EGFP在小鼠的肝臟(圖6c)、肺(圖6d)、腎臟(圖6e)和脾臟中表達(dá)。NP治療顯著降低了病毒對(duì)所有器官的侵襲。通過(guò)Western blotting(圖6b)和免疫熒光分析(圖6f)發(fā)現(xiàn)，ACE2-NPs在阻斷病毒方面比293T-NPs更有效，檢測(cè)小鼠肺中的His標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。
 

圖6. ACE2-NPs對(duì)小鼠S假病毒感染的抑制作用
 

6.ACE2-NPs的生物相容性和生物分布
過(guò)表達(dá)膜受體不影響CMBNPs的生物相容性。我們不斷增加ACE2-NPs的濃度與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)孵育24小時(shí)發(fā)現(xiàn)，ACE2-NPs在劑量達(dá)500 μg/mL時(shí)不影響細(xì)胞存活。在體內(nèi)評(píng)價(jià)中，C57小鼠靜脈注射25 mg/kg ACE2-NPs。NPs在3小時(shí)后幾乎從血液中清除(圖7a)。熒光成像顯示，ACE2-NPs主要分布在肝臟和肺部，可被3,3’-二十八氧雜環(huán)花青素高氯酸鹽(DiO)檢測(cè)(圖7b)。ACE2-NP治療對(duì)血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量影響較小(圖7c)。第一次注射后7天收集主要器官，包括心、肝、脾、肺和腎。蘇木素和伊紅(HE)染色未見(jiàn)組織病理改變(圖7d)，表明其在體內(nèi)無(wú)毒性，為ACE2-NPs作為抗SARS-CoV-2納米拮抗劑的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
 

圖7. ACE2-NPs的分布及毒性分析

研究結(jié)論
本研究制備了具有抗SARS-CoV-2活性的HEK-293T-ACE2細(xì)胞膜納米材料，并對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)。ACE2-NPs中含有豐富的ACE2，這是SARS-CoV-2 S1的關(guān)鍵受體。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，ACE2-NPs與S1結(jié)合，并以劑量依賴的方式阻止病毒配體粘附人腎小管上皮細(xì)胞。由于S1的募集，ACE2-NPs將S假病毒粒子吸附在其表面，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而保護(hù)宿主細(xì)胞免受病毒感染。ACE2-NPs也通過(guò)提高OPA1的表達(dá)和減少細(xì)胞色素c的釋放來(lái)抑制S1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

擎科助力：
本研究中用到的新冠假病毒LV-Spike-nCOV-EGFP和過(guò)表達(dá)腺病毒Adeno-ACE2為擎科生物提供。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Cheng Wang, Shaobo Wang, Yin Chen, etaL. Membrane NanoparticLes Derived from ACE2- Rich CeLLs BLock SARS-CoV-2 Infection. ACS Nano,2021.3.