細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，是一個(gè)“人口”密集的小型社會，里面的組分和分子各司其職，而這種井然有序離不開一個(gè)熱門詞匯——相分離。相分離是什么呢？相分離有什么作用呢？相分離的研究又有什么意義呢？快跟萌 Cece 一起來學(xué)習(xí)一下吧~

 

 

第一次看到 Molecular Biology of the Cell 上的這張圖 (圖 1) 時(shí)萌 Cece 十分吃驚——在細(xì)胞里，100 nm 尺度 (相當(dāng)于頭發(fā)絲直徑的 1/500！) 競能容納下如此多的分子，其擁擠程度不亞于十一黃金周的外灘。更讓人驚嘆的是，在如此擁擠的環(huán)境里，這些生物大分子仍能高效地行使各自的職能。

 

圖 1. 細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成 (黃棕色：RNA；紫色：核糖體；綠色：蛋白質(zhì))^[1]   細(xì)胞是個(gè)擁擠而有序的地方  

細(xì)胞內(nèi)的各種組分如何在正確的時(shí)間、地點(diǎn)上聚集并執(zhí)行其相應(yīng)的功能，是生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的一大問題。近些年來，細(xì)胞內(nèi)一些沒有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)包被的“細(xì)胞器” (Membrane-less organelles/condensates)——又稱生物分子凝聚體 (Biomolecular condensates) 逐漸引起了人們的注意。

與此同時(shí)，液-液相分離 (Liquid-liquid phase separation, LLPS) 的概念火了起來：近幾年的研究表明，相分離是細(xì)胞形成無膜細(xì)胞器的物理化學(xué)基礎(chǔ)。通過相分離，細(xì)胞內(nèi)分子可以實(shí)現(xiàn)特異性的聚集，從而在看似“擁擠而混亂”的細(xì)胞內(nèi)部形成一定的秩序。

 

  這么火的相分離能干些什么？   

相分離 (或相變) 是細(xì)胞內(nèi)類似于油水分離的現(xiàn)象，細(xì)胞中某些可以發(fā)生相互作用的分子 (油水混合物中的油)，可以聚集形成液滴，從“水相”中分離出來。這看似簡單的“分離”，卻可以幫助細(xì)胞實(shí)現(xiàn)“不簡單”的生物學(xué)功能：可以提高蛋白局部濃度，從而激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；可以隔離蛋白與其底物，從而抑制細(xì)胞內(nèi)的某些生化反應(yīng)；還可以感受、并快速響應(yīng)環(huán)境的變化，如溫度、pH、細(xì)胞外源 DNA；細(xì)胞還能以相分離的形式將高濃度的蛋白存儲起來，在需要的時(shí)候再次釋放……

 

圖 2. 相分離具有多樣的生物學(xué)功能^[2]

  我的課題能蹭個(gè)相分離的熱點(diǎn)嗎？  越來越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)他們“最喜愛的分子”會發(fā)生相分離——這正是相分離研究火爆的重要原因。 

那么，什么樣的分子容易發(fā)生相分離呢？ 

 

相分離的關(guān)鍵在于分子間多價(jià)的弱相互作用，沒有相互作用的分子之間不會發(fā)生聚集，而強(qiáng)相互作用的分子更容易形成“固態(tài)聚集”。已知有兩種蛋白結(jié)構(gòu)類型更容易發(fā)生相分離：一類是具有重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白，如 Grb2 的 SH3 結(jié)構(gòu)域可以與 Sos1 上 PRM 結(jié)構(gòu)域發(fā)生弱相互作用，兩者可以發(fā)生相分離；另一類是具有內(nèi)部無序區(qū) (Intrinsic disordered region, IDR) 的蛋白，而 IDR 是非常常見的。 

圖 3. 兩種蛋白結(jié)構(gòu)域易發(fā)生相分離：重復(fù)結(jié)構(gòu)域、內(nèi)部無序區(qū)^[3]

   體外重構(gòu)相分離   

2012 年，Michael Rosen 和 Steven McKnight 發(fā)現(xiàn)純化的蛋白及核酸等能在特定的條件下發(fā)生相分離，首次證實(shí)了相分離能夠通過簡單的生化實(shí)驗(yàn)在體外重復(fù)。體外相分離實(shí)驗(yàn)最大的優(yōu)勢是可以嚴(yán)格控制各個(gè)組分的濃度及反應(yīng)調(diào)節(jié) (如溫度、pH)，更加便于研究相分離現(xiàn)象。體外相分離實(shí)驗(yàn)中會經(jīng)常用到一些大分子擁擠試劑  (Macromolecular crowding agents)，如 PEG (PEG300、PEG400)、Dextran。目前，擁擠試劑促進(jìn)相分離發(fā)生的具體的機(jī)制仍不明確，一個(gè)可能的原因是擁擠試劑模擬了細(xì)胞內(nèi)的高分子濃度的環(huán)境。

 

   相分離與細(xì)胞信號通路   cGAS 是一種核苷酸轉(zhuǎn)移酶，藥物小分子可特異性結(jié)合其酶活口袋，因此具有較高成藥性，是治療多種疾病的有潛力靶點(diǎn)。cGAS 識別并結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中異常存在的 DNA (包括來自病原體的外源 DNA 和細(xì)胞自身損傷或病變而泄露的內(nèi)源 DNA) 后被激活，催化產(chǎn)生第二信使分子 2'3'-cGAMP，開啟下游 STING 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答信號通路。(詳細(xì)見往期：熱門靶點(diǎn) STING丨靶向 cGAS-STING 通路或可治療漸凍癥？) 

圖 4. cGAS-DNA 相互作用推動相分離^[4]

 mTORC1 在調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境分子擁擠和相變中具有重要作用。mTORC1 可通過調(diào)節(jié)核糖體濃度來控制大分子擁擠 (Macromolecular crowding)，從而調(diào)控相分離。 

圖 5. mTORC1 控制相分離和細(xì)胞質(zhì)的生物物理特性^[5]  相分離與小分子藥物研發(fā)  以往藥物研發(fā)過程中，人們簡單地認(rèn)為小分子藥物進(jìn)入細(xì)胞中會均勻地分布。而相分離研究的不斷深入提示著：相分離影響著小分子藥物的分布，因此，我們不僅要把小分子藥物導(dǎo)入正確的細(xì)胞，還需要讓它們到達(dá)正確的“細(xì)胞器”。
另外，靶向相分離也成了具有潛力的藥物研發(fā)方向。一方面，篩選與無膜細(xì)胞器內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用的小分子化合物，它們可能會促進(jìn)或抑制相分離；另一方面，靶向相分離調(diào)控的上游，有研究顯示 ATP 酶、解旋酶、泛素酶以及能夠調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的酶均具有調(diào)控相分離的潛力，因而這些酶的抑制劑/激動劑——尤其是蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾酶的抑制劑，是極具成藥潛力的相分離調(diào)控小分子。
相分離相關(guān)研究如火如荼，逐漸從神經(jīng)退行性疾病擴(kuò)展到癌癥、免疫等領(lǐng)域。然而，仍有許多亟待解決的問題：針對癌癥等疾病我們是該促進(jìn)相分離還是打破相分離？特定小分子藥物是否能進(jìn)出無膜細(xì)胞器？特定小分子藥物是否能精確特異地調(diào)控相分離的發(fā)生……可以說，相分離相關(guān)研究，是機(jī)遇，也是挑戰(zhàn)。 

相關(guān)產(chǎn)品

Lipoamide 丙酮酸脫酰氧化過程中的一個(gè)傳遞乙�；�和氫的輔酶；能夠調(diào)節(jié)相分離，減少 FUS 蛋白的異常聚集。

Lipoic acid 一種抗氧化劑，是線粒體酶復(fù)合物的重要輔助因子；能夠調(diào)節(jié)相分離。

Dextran 以葡萄糖為單糖組成的多糖。作為大分子擁擠試劑，用于相分離研究中。

PEG300 由乙二醇重復(fù)單元形成的水溶性、低免疫原性和生物相容性聚合物。作為大分子擁擠試劑，用于相分離研究中。

PEG400 一種親水性聚乙二醇，可作為物質(zhì)的優(yōu)良溶劑。作為大分子擁擠試劑，用于相分離研究中。 CCK8 Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)

 

參考文獻(xiàn)

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1. Bruce Alberts, et al. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Pub., 1989.

2. Simon Alberti, et al. Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates. Cell. 2019 Jan 24; 176(3): 419-434.
3. Yongdae Shin, Clifford P Brangwynne. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 2017 Sep 22; 357(6357): eaaf4382.
4. Mingjian Du, et al. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 2018 Aug 17; 361(6403): 704-709.
5. M Delarue, et al. mTORC1 Controls Phase Separation and the Biophysical Properties of the Cytoplasm by Tuning Crowding. Cell. 2018 Jul 12; 174(2): 338-349. e20.
6. Asher Mullard. Biomolecular condensates pique drug discovery curiosity. Nat Rev Drug Discov. 2019 Apr 10.
7. Archishman Ghosh, et al. Three archetypical classes of macromolecular regulators of protein liquid-liquid phase separation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Sep 24; 116(39): 19474-19483.
8. Richard John Wheeler, et al. Therapeutics-how to treat phase separation-associated diseases. Emerg Top Life Sci. 2020 Dec 11; 4(3): 307-318
9. Richard J. Wheeler, et al. Small molecules for modulating protein driven liquid-liquid phase separation in treating neurodegenerative disease. BioRxiv(2019): 721001.
10. Salman F Banani, et al. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 May; 18(5): 285-298.
11. Avinash Patel, et al. A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell. 2015 Aug 27; 162(5): 1066-77.