繼2017年美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST, 簡(jiǎn)稱美國國家計(jì)量院) 和食品與藥物管理局（FDA）舉辦了一場(chǎng)專注于細(xì)胞計(jì)數(shù)的研討會(huì)后，2020年12月15日，NIST和Nexcelom Bioscience聯(lián)合舉辦了一場(chǎng)關(guān)于細(xì)胞活率的研討會(huì)。超過40位細(xì)胞治療行業(yè)的相關(guān)人員參加了此次研討會(huì)，共同探討了當(dāng)前細(xì)胞治療產(chǎn)品活率測(cè)量領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。會(huì)議討論結(jié)果發(fā)表在了Cell & Gene Therapy Insights. 以下正文是文獻(xiàn)的全篇翻譯。
 

 

細(xì)胞活率是細(xì)胞治療產(chǎn)品（即以細(xì)胞作為活性物質(zhì)的產(chǎn)品，比如CAR-T細(xì)胞療法）生產(chǎn)和放行的基本測(cè)量指標(biāo)之一。評(píng)估細(xì)胞治療產(chǎn)品 (CTP) 中活細(xì)胞、死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞的存在至關(guān)重要。死細(xì)胞、瀕死細(xì)胞和細(xì)胞碎片可能會(huì)引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)；活細(xì)胞太少則可能會(huì)降低產(chǎn)品的有效性�；盥蕶z測(cè)也可以作為確定CTP的強(qiáng)度或劑量（即活細(xì)胞濃度）的方法，并作為細(xì)胞毒性檢測(cè)的一部分，用來評(píng)估CAR-T的效力。除了在產(chǎn)品表征和放行檢測(cè)中需要評(píng)估細(xì)胞活率外，活率的測(cè)量也可以作為過程控制的指標(biāo)之一，為整個(gè)生產(chǎn)過程的決策提供關(guān)鍵信息（圖1)。

 

活細(xì)胞和死細(xì)胞的定義通常被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞健康連續(xù)動(dòng)態(tài)變化的瞬時(shí)解讀。由于現(xiàn)有的細(xì)胞活率測(cè)量原理、方法和檢測(cè)儀器多種多樣，以及評(píng)估細(xì)胞活率的目的各不相同（圖2），細(xì)胞治療行業(yè)亟需更為嚴(yán)格的方法來選擇、設(shè)計(jì)和控制細(xì)胞活率測(cè)量。

 

 
2020年12月15日，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 （NIST，簡(jiǎn)稱美國國家計(jì)量院）和Nexcelom Bioscience在“細(xì)胞療法分析開發(fā)峰會(huì)”上聯(lián)合舉辦了一場(chǎng)關(guān)于細(xì)胞活率的研討會(huì)，包含了三場(chǎng)主題演講：“細(xì)胞活率測(cè)量：我們真正測(cè)量的是什么?”“你選擇的測(cè)量方法如何影響活率結(jié)果?” 以及“實(shí)驗(yàn)案例和測(cè)量控制” 。每一個(gè)環(huán)節(jié)都探討了在細(xì)胞治療行業(yè)中細(xì)胞活率測(cè)量遇到的共同挑戰(zhàn)，并討論了如何以“fit-for-purpose”（量體裁衣）的方式選擇細(xì)胞活率的測(cè)量方法。超過40位來自于生物技術(shù)企業(yè)、制藥公司、設(shè)備供應(yīng)商、科研實(shí)驗(yàn)室和政府實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)人員加了此次研討會(huì)，討論了如圖3所示的四個(gè)主要議題。

 

 

二十四位與會(huì)者參與了一項(xiàng)問卷調(diào)查，詢問在進(jìn)行細(xì)胞活率測(cè)量時(shí)遇到的共同問題和挑戰(zhàn)。問卷結(jié)果顯示最常見的問題是不確定測(cè)量方法的準(zhǔn)確性，其次是不了解測(cè)量結(jié)果與產(chǎn)品效力的相關(guān)性。整個(gè)行業(yè)遇到的一個(gè)共同挑戰(zhàn)是測(cè)量方法的選擇。79%的參與者表示，他們?cè)谶x擇細(xì)胞活率測(cè)量方法時(shí)最重要的考慮因素是測(cè)量的質(zhì)量，即通過準(zhǔn)確性、精密度、特異性和可重復(fù)性等指標(biāo)來衡量。在細(xì)胞活率測(cè)量所基于的生物指標(biāo)方面，最常用的測(cè)量方法是熒光細(xì)胞核染色法（83%受訪者）。
 
 

在整個(gè)研討會(huì)中，與會(huì)者都強(qiáng)調(diào)了以fit-for-purpose （量體裁衣，符合既定目的與既定用途）為原則開發(fā)細(xì)胞活率測(cè)量方法的必要性�；�于活率測(cè)量的預(yù)期目的（例如在CTP生產(chǎn)過程中，初始單采分離物的表征，在擴(kuò)增過程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞，或用于產(chǎn)品放行等），可以通過三方面的考量來選擇fit-for-purpose的方法：

 

 

這三個(gè)方面的相互作用將主導(dǎo)測(cè)量系統(tǒng)的構(gòu)建。研討會(huì)上關(guān)于樣品屬性和測(cè)量方法之間相互作用的例子在“選擇的測(cè)量方法會(huì)影響活率結(jié)果”一節(jié)中給出。
 
圖1顯示了一個(gè)典型的CTP生產(chǎn)流程，標(biāo)注了需要細(xì)胞活率測(cè)量的幾個(gè)環(huán)節(jié)。評(píng)估細(xì)胞活率的分析方法可能因所處不同步驟而不同。例如，在CAR-T生產(chǎn)過程中，新鮮分離或冷凍保存的PBMC樣本中可能存在RBC殘留或碎片。在這種情況下，細(xì)胞活率和計(jì)數(shù)方法必須僅計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，避免對(duì)紅細(xì)胞、血小板和碎片的非特異性計(jì)數(shù)。而在生產(chǎn)流程的下游環(huán)節(jié)，比如在細(xì)胞擴(kuò)增或放行前的效力檢測(cè)時(shí)，樣本會(huì)更純凈。針對(duì)這些樣本選擇的活率測(cè)量方法可能會(huì)與在生產(chǎn)早期測(cè)量PBMC的方法不同。
 
細(xì)胞活率測(cè)量的另一個(gè)預(yù)期用途是體外細(xì)胞毒性檢測(cè)。在進(jìn)行檢測(cè)之前，需要對(duì)效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量和活率測(cè)量，來正確評(píng)估效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力。細(xì)胞活率測(cè)量的誤差可能會(huì)錯(cuò)誤地評(píng)估效應(yīng)細(xì)胞的特異性殺傷功能。在這種情況下，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的活率測(cè)量可能會(huì)因這些細(xì)胞的不同屬性（即濃度、形態(tài)、穩(wěn)定性等）而不同。 
 
在討論期間，細(xì)胞樣本的屬性也是建立fit-for-purpose活率測(cè)量方法的一個(gè)重要考慮因素。樣本可以有各種各樣的屬性，包括不同水平的碎片、污染細(xì)胞系、形態(tài)特征、聚集性和脆弱度。在確定適合的測(cè)量方法時(shí)，通常要考慮樣品的基本性質(zhì)，如濃度范圍、細(xì)胞類型和懸浮溶液。進(jìn)一步的考慮包括細(xì)胞的狀態(tài)，樣品中可能存在的受污染的細(xì)胞或碎片，以及在活率測(cè)量期間細(xì)胞樣本的穩(wěn)定性。細(xì)胞的狀態(tài)可能受到在活率分析之前經(jīng)過的處理的影響。例如，冷凍后直接解凍的細(xì)胞測(cè)得的活率可能與新鮮制備的細(xì)胞不同。細(xì)胞活率評(píng)估的時(shí)間也可能影響活率測(cè)量的結(jié)果，比如當(dāng)細(xì)胞從凍存中復(fù)蘇或持續(xù)培養(yǎng)中恢復(fù)時(shí)，其屬性可能發(fā)生改變。此外，也需要考慮樣本是否有足夠的量用于測(cè)量。如果樣本量有限，一個(gè)fit-for-purpose的方法需要體積盡可能小的樣品量進(jìn)行分析。其他需要考慮的實(shí)際因素還包括每次分析的成本、通量、自動(dòng)化需求或培訓(xùn)需求，以及法規(guī)或其他方面。
 
當(dāng)開發(fā)一個(gè)合適的活率測(cè)量方法時(shí)，樣品在分析期間的穩(wěn)定性也應(yīng)該是一個(gè)重要的考慮因素。活率測(cè)量通常是一個(gè)瞬時(shí)行為，為活和死的連續(xù)過程捕獲離散的信息。細(xì)胞樣本的活率可能隨時(shí)間或樣品制備過程而改變，死細(xì)胞和污染碎片可能會(huì)增加，或在測(cè)量過程中由于細(xì)胞粘附到離心管壁或移液管而導(dǎo)致細(xì)胞丟失。例如，在流式細(xì)胞術(shù)染色過程中進(jìn)行的樣品清洗步驟可能會(huì)去除部分失活細(xì)胞群而影響活率測(cè)量。細(xì)胞樣本中污染細(xì)胞或碎片的存在是建立活率測(cè)量方法的另一重要考慮因素，方法對(duì)目標(biāo)細(xì)胞群的特異性識(shí)別至關(guān)重要。
 
關(guān)于細(xì)胞樣本的另一個(gè)考慮因素是樣本間的異質(zhì)性。當(dāng)用于分析的樣本之間差別很大時(shí)，比如樣本來自于患有不同程度疾病的捐獻(xiàn)者，一個(gè)fit-for-purpose的方法必須可接納這種差異性，且必須用同等程度差異性的樣本對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。
 
開發(fā)細(xì)胞活率測(cè)量方法除了需要考慮樣本屬性和生物指標(biāo)，還需考慮方法的性能標(biāo)準(zhǔn)（如準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、線性和耐用性）。確保測(cè)量置信度的控制策略也應(yīng)納入fit-for-purpose的細(xì)胞活率測(cè)量方法中。NIST在研討會(huì)上介紹了幾種控制策略，并在“通過控制策略提高活率測(cè)量的置信度”一節(jié)中進(jìn)行了描述。
 
與會(huì)者一致認(rèn)為需要選擇“fit-for-purpose”的細(xì)胞活率測(cè)量方法以滿足預(yù)期目的，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)傳代，細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和確定CTP的劑量和純度。圖4表明，細(xì)胞活率測(cè)量方法的開發(fā)最好可以兼顧細(xì)胞樣本屬性、測(cè)量方法和生物指標(biāo)三方面的考量，以支持其預(yù)期的用途。
 
 

測(cè)量方法本身會(huì)影響樣本，從而影響細(xì)胞活率的檢測(cè)結(jié)果。確定細(xì)胞活率的方法有多種，有的可以直接計(jì)算出樣本中總細(xì)胞、活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量。這種情況下細(xì)胞活率并不是一個(gè)測(cè)量值，而是通過計(jì)算活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例獲得。例如，臺(tái)盼藍(lán)染色法會(huì)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（明亮的中心）和死細(xì)胞（深藍(lán)色）（圖5），再計(jì)算活率，使用公式為

 

 

因此，如果細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果由于測(cè)量方法而受到干擾，則活率結(jié)果也會(huì)受到顯著影響。研討會(huì)討論了細(xì)胞計(jì)數(shù)方法對(duì)細(xì)胞活率結(jié)果的三種影響。第一，由于樣本中存在紅細(xì)胞（RBC）殘留，明場(chǎng)成像和臺(tái)盼藍(lán)染色將對(duì)原代細(xì)胞樣本的活率測(cè)量產(chǎn)生顯著影響；第二，臺(tái)盼藍(lán)染料和染色時(shí)間會(huì)影響死亡和瀕死的免疫細(xì)胞群；第三，基于液流系統(tǒng)的機(jī)械應(yīng)力會(huì)在測(cè)量過程中改變細(xì)胞活率。
 
原代細(xì)胞通常是CTP的關(guān)鍵組成部分。測(cè)量單采血樣本或PBMC等原代細(xì)胞時(shí)的主要問題之一是殘留紅細(xì)胞的存在。使用明場(chǎng)成像和臺(tái)盼藍(lán)染色直接對(duì)這些原代細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)可能會(huì)誤將殘留的紅細(xì)胞也計(jì)數(shù)在內(nèi)。由于紅細(xì)胞在明場(chǎng)成像中也會(huì)顯示為具有明亮中心的圓形物體，因此活細(xì)胞計(jì)數(shù)或細(xì)胞濃度可能會(huì)被高估，從而使計(jì)算出來的細(xì)胞活率百分比增加（圖6A）。在Chan等人先前發(fā)表的文章中，發(fā)現(xiàn)樣本中殘留的紅細(xì)胞濃度是有供體差異的，因此在計(jì)算活率時(shí)會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的可變性（圖6B）。為了提高原代細(xì)胞樣本中活細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，可以利用熒光核染色排除殘留紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片的計(jì)數(shù)（圖7）。熒光細(xì)胞核染料，如吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）可以提高對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞判斷的準(zhǔn)確性，從而提高活率計(jì)算的一致性 。

 

影響細(xì)胞活率計(jì)算的另一個(gè)因素是染料本身，特別是傳統(tǒng)方法常使用的臺(tái)盼藍(lán)。在Chan等人的研究中發(fā)現(xiàn)，在用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)低活率的Jurkat細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行染色后，觀察到三個(gè)形態(tài)學(xué)上不同的群體：活細(xì)胞（明亮的中心），死細(xì)胞（深藍(lán)色）和未知（大的彌散物體）（圖8A）。后續(xù)的定量實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)，死細(xì)胞的密度降低了。結(jié)果顯示，AO/PI染色和臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)得的活細(xì)胞濃度是一致的；但是，臺(tái)盼藍(lán)測(cè)得的死細(xì)胞濃度要低得多。有趣的是，對(duì)熱殺傷的Jurkat細(xì)胞樣本染色時(shí)，未觀察到較大的彌散物體（圖8B）。在發(fā)現(xiàn)了這些彌散物體的存在之后，研究者進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以確定彌散物體的起因和構(gòu)成。在先前獲得的視頻中，發(fā)現(xiàn)這些彌散物體直接來源于與臺(tái)盼藍(lán)相互作用的死亡或?yàn)l死的免疫細(xì)胞（PBMC），證明有可能是染料的滲透作用裂解了細(xì)胞。該現(xiàn)象會(huì)使死細(xì)胞的數(shù)量被低估，從而高估細(xì)胞活率。實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI不會(huì)引起與臺(tái)盼藍(lán)類似的細(xì)胞形態(tài)變化 。
 

前面兩個(gè)例子表明由于活細(xì)胞計(jì)數(shù)和死細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差的影響而導(dǎo)致細(xì)胞活率計(jì)算存在可變性。還有其他因素可以直接影響實(shí)際的細(xì)胞活率，例如染料誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞活率降低。Mascotti等人的研究（2000）表明，臺(tái)盼藍(lán)在大約十分鐘后可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞活率降低，而AO/PI染色方法顯示了長(zhǎng)達(dá)120分鐘的活率穩(wěn)定性。歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)（2.7.29）關(guān)于 “有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率” 的部分提示了在臺(tái)盼藍(lán)染色溶液中細(xì)胞孵育時(shí)間的重要性，并指出在數(shù)據(jù)采集之前，細(xì)胞樣本不應(yīng)在臺(tái)盼藍(lán)溶液中染色超過4分鐘。因此，細(xì)胞樣本的染色時(shí)間會(huì)極大地影響活率計(jì)算結(jié)果并在樣本之間引入差異。
 
最后，在之前的報(bào)告中也觀察到了儀器引起的對(duì)細(xì)胞活率的影響。在Chen等（2017）的研究中，作者描述了他們對(duì)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞活率降低的觀察和定量分析。作者發(fā)現(xiàn)，與基于液流的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀一起使用時(shí)，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）作為稀釋劑會(huì)使細(xì)胞活率降低，這一現(xiàn)象的原因是系統(tǒng)引入的機(jī)械剪切應(yīng)力。此外，長(zhǎng)時(shí)間將細(xì)胞樣本孵育在PBS中也會(huì)使細(xì)胞活率降低。作者發(fā)現(xiàn)幾種其他的稀釋劑可以在長(zhǎng)時(shí)間孵育中保持細(xì)胞樣本的活率，并提供更加精確的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
 
總而言之，能影響活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法可以顯著改變細(xì)胞活率的結(jié)果。重要的是要了解所選細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的原理以及過程，包括細(xì)胞樣本、細(xì)胞樣本制備、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器、試劑、耗材和分析算法等，這些都會(huì)引起細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率計(jì)算的變化。
 
 

細(xì)胞活率測(cè)量的一般工作流程可以歸納為幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

 

 

該過程中的每個(gè)步驟都會(huì)給測(cè)量結(jié)果帶來差異。引起差異的來源和差異的水平取決于細(xì)胞樣本的屬性以及活率測(cè)量方法的類型。控制策略通常會(huì)在測(cè)量過程中的特定節(jié)點(diǎn)實(shí)施一種技巧性的操作，用于提高測(cè)量結(jié)果的置信度。
 
在研討會(huì)上，NIST提出了幾種正在開發(fā)中的控制策略，用以提高細(xì)胞活率測(cè)量，尤其是基于圖像原理的活率測(cè)量的置信度。每種方法都建立了一種途徑來應(yīng)對(duì)由測(cè)量過程中特定節(jié)點(diǎn)引起的潛在變化，例如圖像采集、分析和設(shè)門的步驟。通過這些研究，NIST展示了密切觀察測(cè)量過程中每一步驟 （即從樣本準(zhǔn)備到最終分析）的重要性。這些節(jié)點(diǎn)都有可能為測(cè)量引入顯著差異和誤差。在這里，我們明確了細(xì)胞活率測(cè)量過程中每一步驟的潛在差異來源，并給出了NIST正在開發(fā)的控制策略的示例。
 
取樣是細(xì)胞活力測(cè)量過程中的重要步驟。在此步驟中，通常會(huì)從較大體積的細(xì)胞中取樣一小部分細(xì)胞。如果在此步驟中混勻和移液的操作不當(dāng)，則用于活率測(cè)量的測(cè)試樣本可能無法代表原本大體積的樣本，從而破壞了活率測(cè)量的相關(guān)性。如果細(xì)胞樣本中存在聚團(tuán)，則可能會(huì)影響取樣，就需要在樣本制備和數(shù)據(jù)分析過程中增加其他步驟以解決聚團(tuán)問題。在這些情況下，控制樣本中的細(xì)胞聚團(tuán)很重要，而且監(jiān)測(cè)聚團(tuán)細(xì)胞百分比可以提示使用者注意測(cè)量條件是否存在問題。在采樣步驟中應(yīng)考慮環(huán)境因素，例如溫度和濕度以及樣本的聚集特性。
 
樣本制備是引起測(cè)量差異的另一個(gè)重要來源，由于涉及許多手動(dòng)步驟，通常難以控制。在一些情況下，可以通過自動(dòng)液體工作站處理樣本（自動(dòng)化可以集成到數(shù)據(jù)采集設(shè)備中或者是外部獨(dú)立的液體處理器）來控制樣本制備，或者通過遵循詳細(xì)的樣本制備SOP進(jìn)行控制。此外，試劑和耗材（例如計(jì)數(shù)板）也會(huì)影響測(cè)量質(zhì)量。樣本制備還可能引起樣品屬性的變化。任何導(dǎo)致細(xì)胞死亡的樣本制備步驟對(duì)于活率測(cè)量尤其成問題，應(yīng)進(jìn)行控制以在整個(gè)測(cè)量過程中保持樣本的穩(wěn)定性。
 
數(shù)據(jù)采集和期間使用的儀器通常是細(xì)胞活率測(cè)量過程中的黑匣子，特別是當(dāng)數(shù)據(jù)采集是自動(dòng)化或半自動(dòng)化的情況下。差異來源的控制策略有時(shí)是內(nèi)置在儀器和數(shù)據(jù)采集流程中的；然而與任何自動(dòng)化系統(tǒng)一樣，錯(cuò)誤可能直到測(cè)量值超出預(yù)期范圍時(shí)才被發(fā)現(xiàn)（此時(shí)，超過預(yù)期范圍是由于測(cè)量誤差還是細(xì)胞樣本真實(shí)的生物學(xué)現(xiàn)象導(dǎo)致尚不清楚）。常規(guī)的儀器驗(yàn)證和維護(hù)可以幫助減少數(shù)據(jù)采集中的錯(cuò)誤；然而，確保每一個(gè)樣本都被正確分析仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。采納測(cè)量中過程控制可以幫助在活率分析過程中驗(yàn)證測(cè)量條件。例如，在基于圖像的臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活率測(cè)量中，圖像質(zhì)量，特別是聚焦和圖像亮度會(huì)影響細(xì)胞活率測(cè)量。在運(yùn)用自動(dòng)圖像分析算法之前，圖像必須達(dá)到足夠高的質(zhì)量，這一點(diǎn)至關(guān)重要。 
 
NIST演示了一種將少量微珠摻入細(xì)胞樣品中的方法，以便在基于細(xì)胞計(jì)數(shù)板的成像細(xì)胞活率分析儀（Cellometer Auto 2000，Nexcelom）中進(jìn)行分析。其中微珠作為獨(dú)立于真實(shí)細(xì)胞樣本的人工制品，用于監(jiān)控圖像質(zhì)量。微珠對(duì)圖像聚焦變化很敏感，研究人員利用采集的數(shù)據(jù)表征了微珠的特征與圖像聚焦和亮度之間的關(guān)系。在后續(xù)細(xì)胞活率測(cè)量中，微珠可用于尋找一個(gè)參考聚焦平面；使用者可借助一種開發(fā)出來的工具在每次測(cè)量時(shí)根據(jù)微珠的特征返回到參考的聚焦平面。這種方法提高了從0％活率到接近100％活率的Jurkat細(xì)胞樣品中基于臺(tái)盼藍(lán)自動(dòng)活率測(cè)量的可重復(fù)性，并且提高了以人工細(xì)胞計(jì)數(shù)為參照的測(cè)量準(zhǔn)確性。
 
 

 對(duì)照材料，如商品化的參考微珠和實(shí)驗(yàn)室制備的固定死細(xì)胞樣本，可用于建立細(xì)胞活率測(cè)量中的控制策略。根據(jù)選擇的測(cè)量方法，這些材料會(huì)有非常具體的應(yīng)用。參考微珠的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性好，可以在市場(chǎng)上買到，而且在不同實(shí)驗(yàn)室之間可以保證品質(zhì)的均一。微珠材料可用于建立儀器驗(yàn)證方法，或者如前所述，用于在測(cè)量過程中對(duì)測(cè)量質(zhì)量進(jìn)行的基準(zhǔn)化分析。模擬細(xì)胞屬性（例如散射性和染色特性）的新型合成參考材料也可以用作測(cè)量過程控制，以解決由過程（例如細(xì)胞染色）和數(shù)據(jù)分析（例如細(xì)胞設(shè)門）引起的差異性來源。
 
固定細(xì)胞材料也可以作為一種方便的工具來模擬樣本的特定屬性，如流式細(xì)胞術(shù)中的散射特性或成像方法中的染色特性。細(xì)胞可以保留特定的細(xì)胞特征，如形態(tài)和表面標(biāo)記物。對(duì)于基于細(xì)胞核染色的活率分析方法，固定細(xì)胞尤其有吸引力，因?yàn)楣潭�可以保存�?xì)胞的核物質(zhì)，并使其可用于評(píng)估膜的滲透性。由于固定細(xì)胞的許多特性可能與測(cè)試細(xì)胞非常相似，也許可以與目標(biāo)細(xì)胞相同的方式對(duì)它們進(jìn)行采樣、染色、處理和測(cè)量。在實(shí)用性方面，固定細(xì)胞材料可以大批量生產(chǎn)，并有可能儲(chǔ)存很長(zhǎng)時(shí)間。
 
死亡和瀕死細(xì)胞材料是細(xì)胞活率測(cè)量的一類重要生物參考材料。死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞的外參研究（即恢復(fù)研究）對(duì)于評(píng)估細(xì)胞活率測(cè)量的特異性、線性和靈敏度至關(guān)重要。有多種方法可用來獲得死亡或?yàn)l死細(xì)胞材料，包括熱休克、固定、受限的環(huán)境生長(zhǎng)條件、營養(yǎng)剝奪和化學(xué)處理。這些材料通常是臨時(shí)制備的，因?yàn)樗鼈兛赡懿痪邆溟L(zhǎng)期存儲(chǔ)所需的穩(wěn)定性。重要的是，用于殺死或損傷細(xì)胞的不同方法會(huì)導(dǎo)致死細(xì)胞的不同屬性。例如，一些殺傷方法可能會(huì)造成更多的細(xì)胞碎片，而另一些方法可能會(huì)使細(xì)胞失去活性，但仍然保持相當(dāng)?shù)耐暾�性和均勻性。值得注意的是，�?duì)照材料的屬性范圍應(yīng)該與待測(cè)細(xì)胞樣本的屬性范圍一致。例如，如果需要在生物制造過程的特定步驟中分析細(xì)胞活率，則可以根據(jù)細(xì)胞在此過程的上一步中可能遇到的干擾類型（例如流體應(yīng)力、環(huán)境條件、或營養(yǎng)狀況）來確定對(duì)照物質(zhì)。即使在特定CTP的制造過程中，也尚未有任何一類參考物質(zhì)被認(rèn)證可充分代表用于活率測(cè)量的各種類型的細(xì)胞樣本。實(shí)驗(yàn)室制備死亡或?yàn)l死細(xì)胞控制材料的最佳方案和指導(dǎo)原則將有助于支持細(xì)胞活率測(cè)量控制策略的實(shí)施。
 
 

 如前所述，許多研討會(huì)的參與者都表達(dá)了制定細(xì)胞活率標(biāo)準(zhǔn)的需求。最近發(fā)布的ISO 20391細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)系列中已涉及細(xì)胞活率，并且在一些領(lǐng)域、儀器或特定細(xì)胞類型方面的細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)存在或正在開發(fā)中。例如，ASTM最近致力于開發(fā)一種測(cè)量支架中細(xì)胞活率的測(cè)量方法(ASTM WK62115，“測(cè)量支架中細(xì)胞活力的新測(cè)量方法”)。在國際標(biāo)準(zhǔn)組織 (ISO) 生物技術(shù)委員會(huì)（TC）的ISO TC 276中，分析方法工作組正處于完成有關(guān)細(xì)胞治療產(chǎn)品（CTP）表征和測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)的最后階段，“ ISO / DIS 23033生物技術(shù)-分析方法-表征和檢測(cè)細(xì)胞治療產(chǎn)品的一般準(zhǔn)則”。該標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞活率確定為CTP檢測(cè)中非常重要的質(zhì)量屬性，并建立了對(duì)最終CTP中細(xì)胞活率測(cè)量的要求。該標(biāo)準(zhǔn)還提供了適用于選擇和開發(fā)用于CTP表征和檢測(cè)的分析方法的通用指南，以及方法確認(rèn)和驗(yàn)證的注意事項(xiàng)和要求；但是，它沒有為細(xì)胞活率的測(cè)量提供具體參考。
 
目前，還沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)用以制定細(xì)胞活率相關(guān)的術(shù)語，和指導(dǎo)fit-for-purpose的細(xì)胞活率測(cè)量方法的開發(fā)。一個(gè)更通用的，可以兼顧fit-for-purpose考量和最佳可行性方案的細(xì)胞活率測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)將能夠滿足相關(guān)人員的需求，也將最適合于涉及到廣泛用途和細(xì)胞類型的CTP行業(yè)。細(xì)胞活率的通用標(biāo)準(zhǔn)需要明確細(xì)胞活率的定義和活率結(jié)果報(bào)告的相關(guān)術(shù)語。細(xì)胞活率的結(jié)果報(bào)告應(yīng)包含測(cè)量使用的方法和所測(cè)生物指標(biāo)的信息。例如，當(dāng)報(bào)告一個(gè)細(xì)胞樣本的活率為70%時(shí)，需附加更具體的信息（比如用基于成像分析原理的臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)得）。只有明確了所使用的測(cè)量方法，細(xì)胞活率結(jié)果之間才具有可比性，也才可將結(jié)果用于合適的用途。
 
通用標(biāo)準(zhǔn)還應(yīng)能解決與細(xì)胞樣本相關(guān)的常見挑戰(zhàn)，包括諸如細(xì)胞群體異質(zhì)性，樣本穩(wěn)定性以及污染碎片和細(xì)胞類型等。這些屬性都有可能對(duì)活率測(cè)量方法產(chǎn)生影響。通用標(biāo)準(zhǔn)需要明確的另一個(gè)關(guān)鍵方面是測(cè)量控制策略，包括控制材料的適當(dāng)使用和制備，以及用于驗(yàn)證所選測(cè)量過程的方法，這是需要相關(guān)人員進(jìn)一步考慮的重要領(lǐng)域。使用不同儀器和原理（例如基于流式細(xì)胞儀、成像、電阻抗、代謝物的測(cè)定等）測(cè)量細(xì)胞活率的一般考慮因素也需要被共享。此外，通用標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包含如何比較不同活率測(cè)量方法，以及如何評(píng)估所選方法的適用性的實(shí)驗(yàn)框架和指導(dǎo)原則。
 
 

 隨著近年CTP在提供挽救生命的治療方面的成功，合適和可靠的細(xì)胞活率測(cè)量變得至關(guān)重要。本次研討會(huì)將工業(yè)界、學(xué)術(shù)和政府實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)人員聚集在一起，共同探討了當(dāng)前CTP活率測(cè)量領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)，和提高活率測(cè)量的置信度的可能方法。研討會(huì)參與者確定了fit-for-purpose的細(xì)胞活率方法開發(fā)的關(guān)鍵考慮因素，如樣本屬性、測(cè)量方法，以及用于識(shí)別活細(xì)胞和死細(xì)胞的生物指標(biāo)的選擇。重要的是，樣本屬性和許多測(cè)量過程的步驟之間會(huì)發(fā)生相互作用，這些作用在開發(fā)準(zhǔn)確的、能反映樣本真實(shí)狀態(tài)的分析方法時(shí)是必須著重考慮的。研討會(huì)上的一項(xiàng)重要共識(shí)是需要確定fit-for-purpose的測(cè)量方法，這些方法將為細(xì)胞的既定用途提供最相關(guān)的活率信息。細(xì)胞活率結(jié)果報(bào)告應(yīng)包含測(cè)量方法以及計(jì)算公式的描述。此外，對(duì)照材料和對(duì)照研究的應(yīng)用被證明具有提高細(xì)胞活率測(cè)量置信度的潛力。一套支持選擇、開發(fā)和驗(yàn)證fit-for-purpose的細(xì)胞活率測(cè)量方法的標(biāo)準(zhǔn)將有助于加速CTP的開發(fā)。