//病毒載體概述

根據(jù)病毒載體使用目的可將病毒載體劃分為兩類：一種是廣泛應(yīng)用于科研的“基因表達(dá)載體”，另一種“基因治療載體”則應(yīng)用于臨床居多。病毒載體具有保留病毒高效感染、轉(zhuǎn)染能力以及去除或減少病毒病理功能基因的特征�，F(xiàn)在被使用的病毒載體被稱為“重組病毒載體”。

重組病毒載體包含三大特征：

◆ 去除大多數(shù)病毒功能的基因

◆ 保留病毒顆粒包裝序列

◆ 外源基因和外源基因輔助序列
 

_{（圖片來源：http://www.addgene.org/viral-vectors/）}

 

//病毒載體直接注入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其表達(dá)分析

目前，病毒載體在實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)科學(xué)活體研究中，通常是應(yīng)用病毒直接注射的方式注射到目標(biāo)腦區(qū)，然后在進(jìn)行后續(xù)研究。病毒表達(dá)的鑒定包括：鑒定基因表達(dá)、鑒定蛋白表達(dá)和鑒定神經(jīng)元亞型，具體參考下圖所示。
 

_{（圖片來源：C.N. Cearley.J.H.Wolfe.2006)}
 

//病毒載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞模式

根據(jù)我們注射方式的不同，病毒病毒載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞模式和表達(dá)方式也不盡相同。使用立體定位儀注射模式大多數(shù)會(huì)產(chǎn)生垂直的孔，注射理想狀態(tài)是產(chǎn)生球型擴(kuò)散，實(shí)際情況由于操作精度及針頭停留時(shí)間的一個(gè)情況影響最后擴(kuò)散的模式往往是沿著注射孔徑分布。軸突注射模式主要沿軸突傳遞。腦室/脊髓注射模式則沿腔壁分布。血管注射模式會(huì)沿血管網(wǎng)分布。
 

_{（圖片來源：M. Simonato, et al., 2013.）}

 

//實(shí)驗(yàn)室常用的病毒載體

常用的病毒載體分類為：CMV質(zhì)粒、EBV質(zhì)粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為：皰疹病毒 、腺病毒、腺相關(guān)病毒、狂犬病毒。關(guān)于病毒載體的優(yōu)劣勢(shì)如下圖所見：

◆ Lentivirus（慢病毒）中編碼為RNA，裝載序列容量小于8KB，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較低。

◆ AAV（腺相關(guān)病毒）的劣勢(shì)在于裝載容量偏小只有4.5KB,它的優(yōu)勢(shì)在于免疫反應(yīng)非常低，利于動(dòng)物后期的快速恢復(fù)及后續(xù)的神經(jīng)科學(xué)研究。

◆ Adenovirus(腺病毒)優(yōu)點(diǎn)是裝載容量很大，缺點(diǎn)是造成免疫反應(yīng)很強(qiáng)。

_{（圖片來源：https://www.addgene.org/guides）}

 

//病毒載體的具體分析

◆ 慢病毒（Lentivirus）

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)入病毒，它是RNA逆轉(zhuǎn)為雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組。質(zhì)粒來源廣泛，主要來源于免疫缺陷病毒，比較常用的有HIV-1。慢病毒（Lentivirus）具有的一大特點(diǎn)是廣泛細(xì)胞感染能力，無論是神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、還是神經(jīng)干細(xì)胞均可感染，在Lentivirus包裝過程中它的膜蛋白VSV-G必須要放在包裝質(zhì)粒當(dāng)中，出于對(duì)Lentivirus生物安全性的考慮，我們把真正轉(zhuǎn)入的目標(biāo)外源基因的序列包裝在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上。具體可參考下圖：
 

 

◆ 腺病毒（Adenovirus）

腺病毒基因組的容量特別大（36KB），是DNA類型病毒。在DNA序列當(dāng)中，目前通常將E1替換為外源基因，由于E1基因?qū)τ谙俨《镜纳�命周期是很重要的，替換掉后只能把改造后的腺病毒基因?qū)�入到穩(wěn)定表達(dá)E1蛋白中HEK293細(xì)胞中包裝。包裝完成所產(chǎn)生的病毒溶液會(huì)導(dǎo)致一定程度的炎癥反應(yīng)，容易對(duì)神經(jīng)元造成水腫，對(duì)后續(xù)的行為學(xué)研究、形態(tài)學(xué)研究產(chǎn)生很大的影響，應(yīng)用神級(jí)科學(xué)手術(shù)存在比較明顯的缺陷，因此不適合作為基因治療載體。
 

◆ 腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus）

腺相關(guān)病毒是48KB單鏈的DNA,基因組包括Rep編碼的AAV生命周期相關(guān)蛋白 、Cap編碼的AAV衣殼蛋白兩個(gè)開放閱讀框，另外需要helper plasmid編碼AAV復(fù)制相關(guān)蛋白，待三個(gè)質(zhì)粒全部轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞后，便可包裝成為具有感染能力，但無復(fù)制能力的AAV病毒顆粒。
 

_{（圖片來源：Jacqueline Hunter et al., 2017）}
 

​◆ 重組腺相關(guān)病毒（recombinant AAV,rAAV）

重組腺相關(guān)病毒是目前已發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)簡單的一類單鏈DNA復(fù)制缺陷型病毒，具有安全性高、免疫原性低、宿主細(xì)胞范圍廣和在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間長等特點(diǎn)�？茖W(xué)界現(xiàn)普遍認(rèn)為AAV不會(huì)導(dǎo)致人類疾病，是目前最有前景的基因治療載體�；�因工程化的AAV能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，借助特定啟動(dòng)子、光遺傳學(xué)/化學(xué)遺傳學(xué)元件、鈣指示劑、神經(jīng)遞質(zhì)探針或Cre/lox P，F(xiàn)lp／FRT重組酶技術(shù)，可選擇性地標(biāo)記特定的神經(jīng)元�？筛鶕�(jù)感染對(duì)象細(xì)胞有針對(duì)選擇不同AAV的血清型，越來越多的神經(jīng)環(huán)路研究使用AAV作為神經(jīng)示蹤工具。
 

_{（圖片來源：https://www.addgene.org/guides/aav/）}

◆ 狂犬病毒Rabies Virus

狂犬病毒不同于其它病毒載體，不可以作為廣普的病毒載體感染各類細(xì)胞。作為神經(jīng)科學(xué)研究的工具，狂犬病毒被應(yīng)用的點(diǎn)在于其神經(jīng)專嗜性（neurotropic viruses）。野生型狂犬病毒細(xì)胞內(nèi)高拷貝數(shù)具有細(xì)胞病毒，可逆行多級(jí)神經(jīng)元影響環(huán)路研究分析。產(chǎn)生移除糖蛋白G,重組SAD△G-GFP狂犬病毒不能逆行感染神經(jīng)元。后來通過產(chǎn)生引入外源膜蛋白EnVA重組EnVA-SAD△G-GFP特異感染表達(dá)受體TVA的細(xì)胞進(jìn)行感染。
 

 

//病毒的注射與表達(dá)

◆ 準(zhǔn)備工具

RWD71000全自動(dòng)腦立體定位儀、KDS LEGATO 130微量注射泵、Hamilton微量注射器及MP-500微電極拉制儀拉制出的電極來共同使用：

（▲實(shí)驗(yàn)同款，點(diǎn)擊申請(qǐng)免費(fèi)試用→http://online.rwdls.com/contact?utm_source=wxky&utm_medium=wz&utm_campaign=ganhuo&utm_content=bingdushizhong&utm_term=shiyong）
 

◆ 病毒注射流程

將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，進(jìn)行頭部固定，在立體定位儀上切開頭頂皮膚，清理顱骨表面。

病毒注射前需將小鼠的頭部調(diào)平，調(diào)整鼻夾和耳肝Z軸高度，使小鼠顱骨表面前后左右Z軸高度一致。

根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)的立體定位圖譜坐標(biāo)進(jìn)行調(diào)整，用顱骨鉆鉆開小鼠顱骨，用針尖挑破硬腦膜。

◆ 模式設(shè)置與速度選擇

四種組合工作方式：注射、抽吸、注射/抽吸、抽吸/注射。

流量速率設(shè)置可達(dá)到PI級(jí)別，時(shí)間參數(shù)Hr/Min/Sec都可選，病毒注射速率控制在20nl/min-40nl/min。
 

設(shè)置速率后，可以選擇定時(shí)或定量注射。

注射/抽吸過程，可以實(shí)時(shí)觀察當(dāng)前狀態(tài)。

玻璃微電極的尖端插入到目標(biāo)腦區(qū)的坐標(biāo)深度，注射完畢后電極停留10min,縫合傷口并將動(dòng)物放回籠內(nèi)。新一代的示蹤方法——病毒載體具有突出優(yōu)勢(shì)。病毒載體采用改造后的病毒，安全性高、毒性低、能轉(zhuǎn)入目的基因且選擇范圍廣。依據(jù)其特性可供研究者自由組合使用�？茖W(xué)家們一直努力研究改造病毒，以期獲得毒性更低，感染、傳播、跨突觸機(jī)制更加明確的神經(jīng)示蹤工具病毒，為腦科學(xué)研究提供更強(qiáng)大的工具。

以上僅為課程節(jié)選片段想了解更詳細(xì)病毒示蹤技術(shù)趕快掃碼查看完整課程↓↓還有神經(jīng)環(huán)路系列課程等你來學(xué)~