從全血中提取細(xì)胞樣本是一個(gè)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，因?yàn)檫@類樣本能模擬人體或動(dòng)物的真實(shí)細(xì)胞環(huán)境。相對(duì)于下游的實(shí)驗(yàn)例如藥物篩選、功能研究等會(huì)比單純的細(xì)胞系會(huì)有更好的實(shí)驗(yàn)效果。

從血液中提取細(xì)胞最重要的一步就是去除紅細(xì)胞。以成年人外周血為例，其各種細(xì)胞的數(shù)量及比例如下
表所示:
 

	紅細(xì)胞	白細(xì)胞			血小板
含量 （個(gè)/L）	（4.0-5.5）×1012	（4.0-10.0）×109			（1.0-3.0）×1011
		中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞
占比		50%-70%	20%-40%	3%-8%

 
紅細(xì)胞數(shù)量巨多，為了下游實(shí)驗(yàn)?zāi)苤苽浜玫募?xì)胞樣本必須去除紅細(xì)胞。目前常用去除紅細(xì)胞有以下幾個(gè)方法：
1.氯化銨裂解法：
它既不損傷有核細(xì)胞又能充分的去除紅細(xì)胞。這種方法簡單易行且比較溫和的紅細(xì)胞去除方法，主要用于經(jīng)酶消化分散的組織細(xì)胞的分離純化，淋巴細(xì)胞的分離純化以及組織細(xì)胞蛋白與核酸提取等實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞的去除。經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解得到的組織細(xì)胞中不含紅細(xì)胞，可進(jìn)一步用于原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、流式細(xì)胞分析、核酸與蛋白的分離和提取等。
但是裂解后紅細(xì)胞碎片較多，不易去除。
2.低滲裂解法
利用細(xì)胞滲透作用原理，細(xì)胞在低濃度緩沖液中會(huì)滲透吸水導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，而白細(xì)胞相對(duì)紅細(xì)胞有一定的耐受壓，可以達(dá)到分離的目的。但是低滲法也能對(duì)白細(xì)胞有一定損傷，會(huì)對(duì)后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)有影響。
3.密度梯度離心
常用的兩種介質(zhì)是Ficoll和PercollTM 。Ficoll是蔗糖的多聚體，常用于外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。Percoll是二氧化硅膠體顆粒，可形成連續(xù)和不連續(xù)兩種梯度，主要能分離細(xì)胞，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和病毒的分離。密度梯度離心分離能更好的去除雜細(xì)胞獲取目的細(xì)胞，且不會(huì)損傷細(xì)胞在下游分析中的功能或性能；常用于分選及功能實(shí)驗(yàn)；該方法效果好但是耗費(fèi)時(shí)間長。

全血樣本經(jīng)細(xì)胞提取后用于下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的一步。因此需要對(duì)總的有核細(xì)胞和活細(xì)胞都要進(jìn)行計(jì)數(shù)。雖然臺(tái)盼藍(lán)染色法是常用的活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，但是對(duì)于含有紅細(xì)胞、血小板和雜質(zhì)的樣本，臺(tái)盼藍(lán)染色法不能區(qū)分計(jì)數(shù)有核細(xì)胞、紅細(xì)胞和雜質(zhì)。如果想快速精確計(jì)數(shù)有核細(xì)胞且進(jìn)行精確細(xì)胞活力分析，那么Countstar雙熒光AO/PI細(xì)胞計(jì)數(shù)法必不可少，它能保證計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

 

 
Countstar細(xì)胞分析儀還能對(duì)全血樣本直接計(jì)數(shù)分析。實(shí)驗(yàn)過程如下：
1）取 20µL 血液樣品并用 180µL PBS 稀釋。
2）取 12µL AO/PI 染色液加入 12µL 樣品中，用移液器輕輕混合;
3）將 20µL 混合溶液吸入細(xì)胞計(jì)數(shù)板;
4）讓細(xì)胞在計(jì)數(shù)板內(nèi)靜置約 1 分鐘;
5）將計(jì)數(shù)板放入 Countstar ® FL 儀器;
6）選擇“AO/PI 活率”測(cè)定，然后輸入此樣品的樣品 ID。
7）選擇稀釋比率和細(xì)胞類型，點(diǎn)擊“運(yùn)行”開始測(cè)試。
結(jié)果
1.全血的明場(chǎng)圖像
在全血的明場(chǎng)視野圖像中，有核細(xì)胞淹沒在紅細(xì)胞中不可見。圖1

 
2.全血的熒光圖像
AO 和 PI 染料都能對(duì)細(xì)胞核中的 DNA 染色。因此，血小板、紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片的存在不會(huì)影響白細(xì)胞濃度和活率結(jié)果�；罴�(xì)胞（綠色）和死細(xì)胞（紅色）很容易在熒光圖像中看到（圖 2）。

 

3.白細(xì)胞的濃度和活率
Countstar® Rigel 軟件自動(dòng)對(duì)每個(gè)樣品的三個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)（1202）、濃度（1.83x106細(xì)胞/ ml）和活率（82.04％）的平均值。 全血圖像和數(shù)據(jù)以PDF、圖片或Excel 格式導(dǎo)出進(jìn)行其他分析或數(shù)據(jù)歸檔。

 

在不裂紅時(shí)對(duì)全血進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)可計(jì)算有核細(xì)胞的回收率。采用熒光計(jì)數(shù)法對(duì)分離后的樣本能有效排除細(xì)胞碎片、紅細(xì)胞等雜質(zhì)影響，從而達(dá)到精確計(jì)數(shù)目的。