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Cell Metabolism | 靶向肝臟GLS1可改善非酒精性脂肪肝應用解析

瀏覽次數(shù)：2325　發(fā)布日期：2021-4-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種廣受關注的全球性疾病，其特征為代謝重編程導致的肝臟脂肪累積，包括脂肪酸攝取量增加、線粒體脂肪酸β氧化（FAO）降低、脂肪酸從頭合成脂肪增加，以及極低密度脂蛋白（VLDL）的組裝和分泌功能失調(diào)等。另一方面，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一種更具侵襲性的形式，其特征是肝細胞壞死性炎癥和纖維化，是肝硬化和肝癌的重要危險因素。VLDL合成和分泌功能失調(diào)是NASH的主要特征。

谷氨酰胺酶是肝臟谷氨酰胺代謝的主要調(diào)節(jié)酶，且其中谷氨酰胺酶1（GLS1）已被證明可以抑制肝纖維化的進展，但是GLS1與NAFLD相關性尚缺乏深入研究。本文作者通過研究表明，GLS1在NASH的狀態(tài)下會過表達，且對于GLS1特定的抑制作用可減輕肝臟脂肪變性和氧化應激，因此GLS1可作為一個潛在的NASH治療靶點，相關成果發(fā)表在《Cell Metabolism》上。

谷氨酰胺酶1（GLS1）在NASH臨床患者和小鼠中都過表達

對一大型隊列（健康對照和NASH患者）進行血清谷氨酰胺和谷氨酸（谷氨酰胺酶反應產(chǎn)物）水平檢測，結果顯示兩組中谷氨酰胺雖無明顯差異，但NASH患者的血清中谷氨酸顯著升高（圖1A），表明NASH患者的谷氨酰胺分解代謝是異常的。同樣地，在另一個隊列中，NASH患者GLS1的mRNA水平比健康者高。此外，通常在健康肝靜脈周圍肝細胞中表達的谷氨酰胺合成酶被誘導，催化谷氨酸合成谷氨酰胺并消除門靜脈周肝細胞解毒的殘留氨（圖1B, 1C）。

Figure 1. 谷氨酰胺酶1（GLS1）在臨床非酒精性脂肪性肝炎中過表達

進一步評估NASH臨床前小鼠模型（膽堿和蛋氨酸缺乏飲食MCDD）的GLS1表達水平，結果顯示GLS1的蛋白和mRNA水平以時間依賴性升高（圖2A-2C）。0.1% MCDD（膽堿缺乏和0.1%蛋氨酸飲食）飲食四周后，GLS1主要累積在肝細胞中（圖2E）。

Figure 2. 谷氨酰胺酶1（GLS1）在膽堿和蛋氨酸剝奪而誘導NASH小鼠模型中過表達

體外/體內(nèi)靶向GLS1可改善肝臟脂肪變性

為了鑒定因膽堿和蛋氨酸剝奪而誘導NASH小鼠模型中GLS1表達的主要肝細胞，研究人員將小鼠肝臟分離肝細胞和肝基質(zhì)細胞。結果顯示，0.1% MCDD后分離的肝細胞中Gls1的mRNA水平顯著升高。同樣地，體外激活的培養(yǎng)小鼠原代HSC中，7天后Gls1 mRNA水平增加，與增加的HSC活化對應。利用MCD培養(yǎng)原代肝細胞48 h，沉默Gls1降低了甘油三酯的積累（圖3A-3C），去分化參數(shù)，比如白蛋白、胎蛋白和HNF4，在mRNA水平上均未改變。因此，沉默GLS1可減輕分離的肝細胞脂肪變性。

隨后，對0.1% MCDD小鼠進行Gls1沉默處理，肝臟GLS1水平降低，GLS2表達增加，谷氨酰胺合成酶表達在蛋白質(zhì)水平上沒有明顯改變。在這種情況下，通過測定¹³C標記的谷氨酰胺到谷氨酸確定谷氨酰胺酶活性降低，證實了一方面谷氨酰胺酶活性在飲食中被誘導，另一方面在體內(nèi)Gls1沉默后谷氨酰胺酶活性下降的趨勢。重要的是，在mRNA和蛋白水平上，體內(nèi)GLS1特異性沉默顯著減輕了肝臟脂肪變性（圖3D）。

Figure 3. 體外和體內(nèi)靶向沉默谷氨酰胺酶1（GLS1）緩解肝甘油三酯和非酒精性脂肪性肝炎的積聚

蛋氨酸和膽堿剝奪后體內(nèi)外靶向GLS1可恢復VLDL的分泌

磷脂需要VLDL的正確組裝，蛋氨酸和膽堿的剝奪會導致VLDL的分泌受損。研究人員評估了體內(nèi)外Ptd-Chol合成和VLDL分泌中Gls1沉默的作用。利用（U-¹³C）葡萄糖培養(yǎng)和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)在蛋氨酸和膽堿剝奪的情況下，Ptd-Chol中碳示蹤劑呈降低趨勢，反映了葡萄糖合成Ptd-Chol受損，而Gls1沉默促進了一些Ptd-Chol的合成。此外，利用lomitapide（可阻礙VLDL分泌）處理分離的小鼠肝細胞，結果發(fā)現(xiàn)細胞脂質(zhì)積累的程度與蛋氨酸和膽堿剝奪類似。有趣的是，在這些條件下，Gls1沉默不能阻止lomitapide處理后細胞脂質(zhì)的積累，提示Gls1沉默誘導的降脂可能與VLDL的分泌有關。

此外，0.1% MCDD體內(nèi)沉默Gls1后，肝臟Ptd-Chol和磷酯酰絲氨酸（Ptd-Ser）水平升高，而Ptd-Et的水平不變（圖4B）；分泌的VLDL顆粒的脂質(zhì)成分如甘油三酯、磷脂和膽固醇衍生物顯著增加（圖4C）。因此，Gls1沉默通過靶向VLDL組裝來減輕肝臟脂肪變性。

Figure 4. 體外和體內(nèi)靶向谷氨酰胺酶1（GLS1）恢復膽堿和蛋氨酸剝奪后極低密度脂蛋白（VLDL）甘油三酯的輸出

體內(nèi)外靶向GLS1降低氧化應激

氧化應激在NASH的發(fā)病機理和進程中起著至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸和膽堿缺乏培養(yǎng)的小鼠原代肝細胞中總的和線粒體活性氧（ROS）水平是升高的（圖5A）。四周0.1% MCDD與氧化型谷胱甘肽（GSSG）/還原型谷胱甘肽（GSH）比例和標記的谷氨酰胺到GSH的增加有關。在這些條件下GSH合成增加，并在Gls1沉默下恢復（圖5B）。CD-HFD飲食小鼠在GLS1沉默條件下，GSSG/GSH也降低（圖5C），脂質(zhì)過氧化標志物丙二醛（MDA）水平降低（圖5D）。值得注意的是，Gls1沉默可顯著降低原代肝細胞和體內(nèi)NASH模型中的氧化應激。

接下來，研究人員通過U-¹³C谷氨酰胺到1-¹³C檸檬酸測定了肝臟TCA循環(huán)活性，通過放射性標記的棕櫚酸到CO₂和氧化型酸-溶解代謝物（ASM）測定肝臟FAO，以及通過耗氧率測定線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）。四周0.1% MCDD后，所有分析參數(shù)明顯升高，重要的是，Gls1沉默可恢復TCA、β氧化和OXPHOS通量，以控制與氧化應激降低的飲食水平（圖5E-5G）。因此，體內(nèi)外靶向GLS1可通過減少氧化代謝來降低ROS水平。

Figure 5. 體內(nèi)外靶向谷氨酰胺酶1（GLS1）降低氧化應激

GLS1介導的氧化應激與肝臟磷脂含量的恢復有關

Gls1沉默后，參與轉硫途徑的基因表達降低，而參與葉酸和蛋氨酸循環(huán)的酶的表達增加（圖6A）。同樣地，Gls1沉默可誘導參與CDP-膽堿和CDP-乙醇胺途徑的基因mRNA水平和催化不同磷脂之間堿基交換的酶（圖6B）。

Figure 6. GLS1介導的氧化應激的減少與磷脂合成增加以及葉酸和蛋氨酸循環(huán)的激活有關

小結

本文通過GLS1基因沉默以及脂質(zhì)組和¹³C代謝流分析等技術，發(fā)現(xiàn)抑制GLS1促進了絲氨酸代謝重編程，從谷胱甘肽生成和一碳代謝循環(huán)轉移到蛋氨酸循環(huán)，恢復了肝臟磷脂酰膽堿（PC）含量和極低密度脂蛋白的分泌，有效緩解脂肪變性，驗證了GLS1相關的脂代謝在NASH的氧化還原和肝臟脂肪積累中至關重要的作用。該研究表明靶向作用GLS1是一種有價值的治療NASH的方法。

Figure 7. 谷氨酰胺酶1（GLS1）抑制非酒精性脂肪性肝炎的流程圖

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參考文獻

Targeting Hepatic Glutaminase 1 Ameliorates Nonalcoholic Steatohepatitis by Restoring Very-Low-Density Lipoprotein Triglyceride Assembly. Cell Metabolism. 2020.

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