隨著代謝組學(xué)的發(fā)展與研究認(rèn)識(shí)的不斷深入，越來(lái)越多的代謝組學(xué)專家學(xué)者逐步深刻認(rèn)識(shí)到代謝組學(xué)方法必須從早期興起的非靶向定性分析過(guò)度到靶向絕對(duì)定量檢測(cè)分析，絕對(duì)定量獲得代謝物的準(zhǔn)確濃度才能更快的實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，并精準(zhǔn)匹配大量臨床隊(duì)列樣本的檢測(cè)需求。但由于代謝物的化學(xué)多樣性及濃度范圍差異性巨大等原因，想要在一個(gè)方法下實(shí)現(xiàn)成百甚至上千種代謝物的絕對(duì)定量檢測(cè)困難重重。近日，上海市第六人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心主任&麥特繪譜創(chuàng)始人賈偉教授研究團(tuán)隊(duì)基于化學(xué)衍生法開(kāi)發(fā)的UPLC-TQMS代謝組學(xué)檢測(cè)方案，可以對(duì)324種不同類別代謝物實(shí)現(xiàn)同時(shí)絕對(duì)定量檢測(cè)分析，并經(jīng)過(guò)多個(gè)臨床隊(duì)列樣本的驗(yàn)證，相關(guān)方法學(xué)成果于2021年4月2日成功發(fā)表分析方法學(xué)類頂刊《Analytical Chemistry》。麥特繪譜已將該方法成功生產(chǎn)為質(zhì)譜試劑盒產(chǎn)品，可在Waters、Sciex、Agilent、Thermo、Shimadzu等各大廠商質(zhì)譜平臺(tái)應(yīng)用，同時(shí)配置TMBQ數(shù)據(jù)處理軟件。此外，麥特繪譜擁有自主研發(fā)的數(shù)據(jù)分析云平臺(tái)（iMAP），更有最專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)加持，可以為科研及臨床研究工作者提供標(biāo)準(zhǔn)化、一站式代謝組學(xué)整體解決方案。

一、Q300全定量檢測(cè)方法學(xué)考察

圖1 Q300代謝芯片的分析流程

線性和定量限：根據(jù)代謝物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比與代謝物濃度作圖，獲得校正曲線。根據(jù)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品一系列不同濃度，通過(guò)線性回歸模型確定響應(yīng)線性。大多數(shù)代謝物的線性相關(guān)系數(shù)（R²）均大于0.9900，且具有較寬線性濃度范圍的檢測(cè)能力，通過(guò)自主開(kāi)發(fā)的TMBQ軟件提供相應(yīng)的信噪比（S/N），可以快速確定每種化合物的定量限。

重現(xiàn)性：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)混合物和生物樣本（人血清、尿液、糞便、細(xì)胞和小鼠肝臟等）考察了自動(dòng)衍生化技術(shù)和UPLC-TQMS的方法重現(xiàn)性。六種獨(dú)立制備的標(biāo)準(zhǔn)混合物和樣品分別進(jìn)行連續(xù)重復(fù)測(cè)量分析。在人血清、尿液、糞便樣品、HepG2細(xì)胞和小鼠肝臟樣品中鑒定出的大多數(shù)測(cè)試化合物和代謝物均具有優(yōu)異的重現(xiàn)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15％。

回收率：分別采用人血清、尿液、糞便、細(xì)胞和小鼠肝組織樣品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)考察代謝物回收率。大多數(shù)代謝物具有良好的準(zhǔn)確度，回收率在80%～120%之間，CV小于15%。

圖2 （a）Q300代謝芯片技術(shù)可測(cè)的代謝物類別；（b）3-NPH衍生化過(guò)程；（c）質(zhì)控圖

代謝物衍生化數(shù)據(jù)庫(kù)：研究團(tuán)隊(duì)首先開(kāi)發(fā)了由324個(gè)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的3-NPH衍生物組成的MS/RT庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了許多化學(xué)類別代謝物（圖2A），包括氨基酸（18％）、膽汁酸（12％）、苯甲酸酯（7％）、碳水化合物（7％）、脂肪酸（含短鏈脂肪酸）（ 24％）、吲哚（2％）、肉堿（6％）、有機(jī)酸（13％）和其他（11％）。代謝物3-NPH衍生反應(yīng)如圖2B所示。

方法學(xué)應(yīng)用: 分別對(duì)HepG2細(xì)胞、小鼠肝臟、人血清、尿液和糞便等生物樣本進(jìn)行代謝物檢測(cè)分析。每個(gè)樣本均采用自動(dòng)化衍生法及LC-TQMS檢測(cè)分析。每10個(gè)研究樣本間插入一個(gè)QC樣本，QC樣本可以評(píng)估衍生化和儀器的變異性，通過(guò)混合樣品制備QC樣本。質(zhì)量控制對(duì)于確保代謝物定量的可重現(xiàn)性、可靠性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性至關(guān)重要。如主成分分析（PCA）評(píng)分圖所示（圖2C），QC樣品相對(duì)于其余的血清、尿液和糞便樣品成簇緊密結(jié)合，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

二、Q300全定量代謝芯片試劑盒

基于Q300全定量分析方法，目前開(kāi)發(fā)了首款涵蓋多代謝物類群的Q300全定量代謝芯片試劑盒（簡(jiǎn)稱：Q300試劑盒），并大量應(yīng)用于科研檢測(cè)及臨床研究。該試劑盒包含所有參考標(biāo)準(zhǔn)混合物（具有系列稀釋濃度）、QC樣本、內(nèi)標(biāo)、稀釋后的內(nèi)標(biāo)溶液、96孔板、96孔鋁箔和96孔板粘合膜。該技術(shù)已獲得發(fā)明專利和產(chǎn)品注冊(cè)證（專利號(hào)：No.ZL201811223486.X，粵深械備20210363）。

臨床應(yīng)用: 采用Q300試劑盒，對(duì)1234例慢性肝病合并慢性乙型肝炎（HBV）感染患者（31例單純乙肝患者、117例1期肝纖維化患者、105例2期肝纖維化患者、45例3期肝纖維化患者、51例肝硬化患者，467例肝細(xì)胞癌患者（HCC）、76例肝內(nèi)膽管癌患者（ICC）和342例健康對(duì)照者)進(jìn)行代謝組學(xué)研究。共使用26個(gè)試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行分析，每個(gè)試劑盒內(nèi)含有5個(gè)合并的QC樣品。以PCA的第一個(gè)主成分（PC1）為y軸，以進(jìn)樣順序?yàn)閤軸，建立多變量控制圖（MCC）如圖3a所示，測(cè)試過(guò)程中的波動(dòng)均在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（±1SD）內(nèi)，表明測(cè)試穩(wěn)定可靠。PCA模型（R2X = 0.471，Q2cum = 0.257，圖3b）、交叉驗(yàn)證的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）（R2X = 0.296，R2Ycum = 0.865，Q2cum = 0.846）和熱圖（圖3c）均證實(shí)，正常、肝纖維化和肝癌人群的代謝譜具有明顯的可分性，大量代謝物的濃度在三組之間有顯著差異。

圖3 （a）測(cè)試過(guò)程的多變量控制圖；（b）正常、肝纖維化和肝癌人群血清定量代謝譜的PCA圖；（c）正常、肝纖維化和肝癌人群血清中287個(gè)代謝物濃度的熱圖

值得注意的是，癸二酸、辛�；�肉堿、十五烷酸、L-天冬氨酸、2-甲基戊酸、蘇糖酸、L-色氨酸、赤蘚酸、3-甲基-2-氧代戊酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸這些代謝物在對(duì)照組中含量豐富，在纖維化和癌癥患者中水平逐漸降低。與健康對(duì)照組相比，肝病患者L-酪氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇酸、葡萄糖、2-羥基丁酸、酮戊二酸、甘脫氧膽酸、�；敲撗跄懰�、甘脫氧膽酸、甘膽酸、�；悄懰岷团；敲撗跄懰崴�平增加（圖4a）。進(jìn)一步根據(jù)不同的診斷目標(biāo)，基于顯著改變的代謝物（圖4a、4d和4g）構(gòu)建一系列組合變量，其區(qū)分健康對(duì)照和纖維化患者（圖4b）的ROC曲線下面積（AUC）為1.000，區(qū)分纖維化和肝癌的AUC為0.990（圖4c），區(qū)分肝纖維化與肝硬化的AUC為0.969（圖4e），區(qū)分HCC和ICC的AUC為0.799（圖4f）。

圖4（a）正常、肝纖維化和肝硬化之間的差異代謝物濃度的熱圖；（b）基于a中代謝物的組合變量區(qū)分對(duì)照組和纖維化患者的ROC曲線；（c）基于a中代謝物的組合變量區(qū)分肝纖維化和肝癌患者的ROC曲線；（d）肝炎、纖維化不同時(shí)期和肝硬化之間的差異代謝物濃度的熱圖；（e）基于d中代謝物的組合變量區(qū)分肝纖維化與肝硬化患者的ROC曲線；（f）基于g中代謝物的組合變量區(qū)分肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌患者的ROC曲線；（g）肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌之間的差異代謝物濃度的熱圖。

三、Q300試劑盒跨國(guó)平臺(tái)轉(zhuǎn)移

可喜的是目前Q300試劑盒已成功轉(zhuǎn)移至代謝組學(xué)之父Jeremy Nicholson實(shí)驗(yàn)室并大量應(yīng)用于大隊(duì)列樣本檢測(cè)分析。Nicholson教授系英國(guó)皇家醫(yī)學(xué)科學(xué)院院士，現(xiàn)任帝國(guó)理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科與腫瘤系主任，MRC-NIHR表型組研究中心主任，復(fù)旦大學(xué)榮譽(yù)教授，其最廣為人知的學(xué)術(shù)成果在于明確提出了“代謝組學(xué)”的概念，并建立了系統(tǒng)的代謝組學(xué)研究方法，開(kāi)辟了全新的研究領(lǐng)域，被譽(yù)為“代謝組學(xué)之父”。Q300試劑盒在Jeremy Nicholson實(shí)驗(yàn)室成功轉(zhuǎn)移及應(yīng)用標(biāo)志著該試劑盒的穩(wěn)定性、可靠性等方面均得到高度認(rèn)可。此外，該試劑盒在綠谷制藥、華大基因、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海市精神衛(wèi)生中心、華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院等多客戶端大量應(yīng)用中，得到了科研及臨床研究工作者們的一致好評(píng)!

Guoxiang Xie, Lu Wang, Tianlu Chen, Kejun Zhou, Zechuan Zhang, Jiufeng Li, Beicheng Sun, Yike Guo, Xiaoning Wang, Yixing Wang, Hua Zhang, Ping Liu, Jeremy K. Nicholson, Weihong Ge, Wei Jia. A Metabolite Array Technology for Precision Medicine. Analytical Chemistry. 2021, 3/29/2021 15:32:47. https://doi.org/ 10.1021/acs.analchem.0c04686.

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