圖1 “閃光冷凍”示意圖

今天為大家介紹一種新穎的、可用于完整的哺乳動(dòng)物急性腦切片和器官切片培養(yǎng)的快速和冷凍方法，該方法探索了小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）的結(jié)構(gòu)和功能，囊泡池的變化。

內(nèi)容摘要

神經(jīng)科學(xué)的主要重點(diǎn)是進(jìn)一步理解突觸的結(jié)構(gòu)和功能，以及兩者之間的關(guān)系。盡管對(duì)突觸傳遞的認(rèn)知有了重要進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題沒(méi)有得到解答。由于中樞突觸的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能高度多樣化，因此對(duì)突觸進(jìn)行精確分析對(duì)逾越這些知識(shí)鴻溝大有裨益。

電鏡提供了具有納米級(jí)別的空間分辨率，然而它有一個(gè)很明顯的缺點(diǎn)就是只能捕捉靜態(tài)圖像。為了分析活標(biāo)本中的突觸，通常使用共聚焦、雙光子和超高分辨技術(shù)成像，然而這些技術(shù)經(jīng)常用于離體培養(yǎng)的神經(jīng)元，很難達(dá)到足夠的分辨率來(lái)識(shí)別單個(gè)的激活區(qū)或單個(gè)突觸囊泡。因此，想要洞悉中樞突觸的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，需要尋找一項(xiàng)兼顧捕捉納米級(jí)空間和毫秒級(jí)時(shí)間分辨率的技術(shù)。

與以往報(bào)道方法不同的是，這種改進(jìn)的“閃光與冷凍”技術(shù)，可應(yīng)用于急性切片和類器官切片培養(yǎng)。這些優(yōu)勢(shì)源于使用了薄的急性切片、改進(jìn)后的載體幾何結(jié)構(gòu)、恢復(fù)方案及低溫保護(hù)和冷凍技術(shù)。

基于這一依據(jù)，這一技術(shù)被應(yīng)用于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）。苔蘚纖維突觸具有大突觸末端，形態(tài)超微結(jié)構(gòu)明顯，突觸囊泡數(shù)量多，囊泡直徑變化大，存在致密的核囊泡。從生理學(xué)角度看，該突觸初始釋放概率低、突觸可塑性高。

實(shí)驗(yàn)方法

選擇專用于研究突觸前神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因小鼠，Prox1啟動(dòng)子靶向這些樣本的齒狀回顆粒細(xì)胞。將pro1-creert2系與Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠雜交，選擇性表達(dá)通道型視紫紅質(zhì)。借助免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀測(cè)EYFP在顆粒細(xì)胞中的選擇性表達(dá)。急性切片制備與器官切片培養(yǎng)方式如前所述，使海馬苔蘚纖維保持最佳狀態(tài)，以用于電生理學(xué)和高壓冷凍（HPF）實(shí)驗(yàn)。

首先，對(duì)急性切片與器官切片培養(yǎng)中光刺激下的突觸傳導(dǎo)進(jìn)行了深入的電生理學(xué)特征分析，以確定“閃光冷凍”實(shí)驗(yàn)的最佳參數(shù)，比如脈沖持續(xù)的時(shí)間和頻率。為了匹配EM ICE高壓冷凍系統(tǒng)，需注意控制刺激的功率和強(qiáng)度。

圖2 優(yōu)化后的“閃光冷凍”技術(shù)工作流

接下來(lái)，借助EM ICE系統(tǒng)進(jìn)行高壓冷凍和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2進(jìn)行冷凍替代。用杜氏樹脂對(duì)切片和器官培養(yǎng)物進(jìn)行包埋，然后用EM UC7冷凍超薄切片機(jī)制成超薄切片。

最后用透射電鏡(TEM)觀察樣品。根據(jù)苔蘚纖維的特性和形態(tài)差異，在海馬CA3區(qū)發(fā)現(xiàn)了苔蘚纖維末端。重點(diǎn)分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中活動(dòng)區(qū)的著位囊泡的數(shù)量和直徑，以及在半活動(dòng)區(qū)的潛在內(nèi)吞凹陷形成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

“閃光冷凍”電鏡的拍攝的HPF小鼠急性腦片海馬CA3區(qū)圖像如下：A)低倍鏡圖像顯示青苔狀纖維軸突(綠色箭頭)穿過(guò)透明層，CA3錐體神經(jīng)元樹突(藍(lán)色箭頭)穿過(guò)青苔狀纖維，少量青苔狀纖維(紅色箭頭)位于這些樹突和軸突之間。B)高倍鏡圖像顯示苔蘚纖維(紅色箭頭)布滿突觸囊泡和苔蘚纖維軸突(綠色箭頭)。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)體系保留了急性切片最佳超微結(jié)構(gòu)，可媲美無(wú)光遺傳學(xué)刺激的HPF類器官腦片的超微結(jié)構(gòu)。

圖3 HPF急性切片的EM圖像

結(jié)果顯示，“未釋放”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已釋放”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之間有重疊，即兩種囊泡具有共同的結(jié)構(gòu)和功能部分，這為隨后突觸的快速內(nèi)吞作用提供了證據(jù)。

此外，作者展示了中度刺激后內(nèi)吞的孔狀結(jié)構(gòu)外觀，提供了快速網(wǎng)格蛋白獨(dú)立的內(nèi)吞機(jī)制的結(jié)構(gòu)證據(jù)。

圖4 結(jié)果示意圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

這項(xiàng)研究表明了了“閃光冷凍”技術(shù)的廣泛適用性，可用于小鼠海馬組織的急性切片和器官切片培養(yǎng)，也可用于包括小腦和腦干在內(nèi)的多種大腦區(qū)域的急性切片。
總的來(lái)說(shuō)，這一整體升級(jí)后的“EM”技術(shù)可用于急性大腦切片突觸傳遞過(guò)程中的多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的囊泡池變化（結(jié)構(gòu)和功能）機(jī)制研究。

高壓冷凍儀 Leica EM ICE

高壓冷凍能夠捕捉精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的錯(cuò)綜變化，結(jié)合光刺激或電刺激的高壓冷凍技術(shù)是您獲得新發(fā)現(xiàn)的平臺(tái)。