徠卡超薄切片技術(shù)的原理與應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1803　發(fā)布日期：2021-3-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

對(duì)樣本開展研究時(shí)，為了以納米級(jí)分辨率顯示其精細(xì)結(jié)構(gòu)，通常會(huì)使用到電子顯微鏡。

電子顯微鏡有兩種類型：掃描電子顯微鏡（SEM）用于對(duì)樣本表面成像，以及需要使用極薄電子透明樣本的透射電子顯微鏡（TEM）。因此，使用電子顯微鏡對(duì)樣本內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像時(shí)，此類技術(shù)解決方案需要制作出非常薄的樣本切片。被稱為超顯微技術(shù)的樣本制備方法可以產(chǎn)生具有最小偽影的超薄切片（厚度20-150nm）。

在切片過程中，樣本的塊面（切割切片處）始終保持在一個(gè)平直的表面上，可供SEM進(jìn)行研究。當(dāng)截面在陣列中成像時(shí)，就可以重建樣本的三維圖像。這種方法稱為陣列斷層掃描（AT）。超薄切片技術(shù)及其在AT中的應(yīng)用概述如下。

超薄切片技術(shù)

超薄切片技術(shù)主要用作透射電子顯微鏡（TEM）的樣本制備方法。它允許樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以納米級(jí)分辨率進(jìn)行可視化和分析。它以快速、干凈的方式制作超薄的樣本切片。超薄切片技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是切片內(nèi)電子透明區(qū)域的大小和均勻性以及切片產(chǎn)生的速度。

超薄切片技術(shù)可用于多種類型的樣本，包括生物學(xué)試樣和工業(yè)材料如聚合物（橡膠和塑料）以及韌性、硬質(zhì)或脆性材料（金屬或陶瓷）等。制備這些樣本薄片還有其他技術(shù)，如聚焦離子束（FIB）銑削、離子刻蝕、三腳架拋光和電化學(xué)處理，但超薄切片技術(shù)在速度和清潔度方面具有優(yōu)勢(shì)。

陣列斷層掃描 (AT) 是一種用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的高分辨率三維圖像重建方法。該技術(shù)利用掃描電子顯微鏡（SEM）或光學(xué)顯微鏡（LM）中超薄、樹脂包埋連續(xù)切片的有序陣列成像。AT技術(shù)能夠?qū)?xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開展定量立體結(jié)構(gòu)分析和可視化觀察。其橫向和空間分辨率比傳統(tǒng)的共焦顯微鏡更理想。此外，通過生物試樣的部分自動(dòng)化檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)更高的處理量。

超薄切片原理

利用陣列斷層掃描進(jìn)行TEM觀察以及實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化3D重建時(shí)，超薄有序的切片是一大前提。超薄切片機(jī)（如徠卡顯微系統(tǒng)的EM UC7）則可以制作出此類超薄的樣本切片（厚度20 ~ 150 nm）。

要在透射電子顯微鏡中形成樣本的圖像，電子必須在不出現(xiàn)任何重大速度損失的情況下穿透樣本。樣本對(duì)電子輻射的滲透率部分取決于其質(zhì)量和厚度（厚度×密度），部分取決于電子顯微鏡的加速電壓。被試樣吸收的電子會(huì)導(dǎo)致熱量積聚，從而在物體中形成偽影。

圖1：顯示超薄切片機(jī)樣品臂、刀座和水槽式玻璃刀的側(cè)視圖。

使用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片時(shí)，需將樣本插入安裝在特殊軸承上的樣品臂當(dāng)中，由該軸承執(zhí)行電動(dòng)垂直切割運(yùn)動(dòng)。切割截面并縮回試樣支臂后，極其精確的機(jī)電進(jìn)給將試樣稍微向前移動(dòng)，移動(dòng)距離與所需截面厚度相對(duì)應(yīng)。通過將試樣垂直移動(dòng)到固定玻璃刀或金剛石刀的鋒利刀片上進(jìn)行切片。由于切片過薄，直接從刀片上取下切片很困難。

因此，它們是在切片程序后從水槽中水面上收集的（或在冷凍切片的情況下借助顯微操作器）。在用電子顯微鏡（EM）檢查之前，可能需要做任何進(jìn)一步的準(zhǔn)備。

陣列斷層掃描的試樣制備

為AT制備生物學(xué)軟試樣時(shí)需要完成若干步驟的操作。這些步驟包括：

組織固定
試樣提取和樹脂包埋
連續(xù)切片和切片帶收集，形成切片陣列
視需要對(duì)切片進(jìn)行染色以供成像。

然后通過SEM或LM（通常為熒光）對(duì)切片陣列成像。后續(xù)將陣列中的切片圖像合并在一起進(jìn)行3D圖像重建和分析。

很多超薄切片機(jī)的AT樣本制備涉及多個(gè)耗時(shí)繁瑣的手動(dòng)操作步驟。高級(jí)超薄切片機(jī)（如徠卡顯微系統(tǒng)ARTOS 3D）則可通過試樣切片的自動(dòng)化處理來加速整個(gè)制備過程，最大限度縮短SEM或LM成像中的切片處理時(shí)間。

應(yīng)用圖像