吸附概述
目前，將生物配體附著到用作免疫學(xué)試驗(yàn)和測(cè)定的固相支持物微球上的方法，通常包括吸附到普通聚合物微球上，共價(jià)附著于表面功能化微球上以及附著到預(yù)先包被有通用結(jié)合蛋白質(zhì)（例如鏈霉親和素或蛋白質(zhì)A）的微球上。
將蛋白質(zhì)附著到疏水性微球上的原始方法是被動(dòng)吸附。 由于這種方法的簡(jiǎn)單性和靈活性，因此今天仍然被廣泛使用。
以下信息說(shuō)明了建立有效吸附方案所涉及的一些變量，以便可以輕松地針對(duì)特定應(yīng)用優(yōu)化列出的通用方案。
吸附機(jī)理主要基于吸附配體的疏水部分與微球聚合物表面之間的疏水（范德華力）吸引力。 這是大多數(shù)疏水性配體（包括免疫球蛋白）的附著方式。 在疏水性配體較少的情況下（或親水性更高的微球，例如-COOH改性），可以通過(guò)離子相互作用和疏水性相互作用進(jìn)行連接。人血清白蛋白和血紅蛋白是此類配體的實(shí)例。 這樣做的重要性在于，其附著部分是由于離子相互作用而引起的配體會(huì)受到其懸浮環(huán)境條件的影響，與僅通過(guò)疏水作用進(jìn)行附著相比，pH值的變化更有可能導(dǎo)致脫附。 因此，我們通常建議將吸附緩沖液的pH值保持在蛋白質(zhì)的pI或附近。
在抗體的情況下，蛋白質(zhì)的Fc部分通常比Fab區(qū)更疏水，因此更可能被吸附（有助于確保蛋白質(zhì)以其最具生物活性的方向結(jié)合）。 但是，抗體可能會(huì)以低于最佳方向的方向結(jié)合，可以通過(guò)添加大量過(guò)量的配體來(lái)防止這種情況，以確保擁擠，直立地吸附蛋白質(zhì)。
疏水配體吸附到聚合物微球可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行：
1. 被動(dòng)吸附：通過(guò)將兩者簡(jiǎn)單地一起孵育固定，即可將目標(biāo)配體連接到微球上的吸附。 由于雜質(zhì)將通過(guò)相對(duì)親和力和相對(duì)濃度效應(yīng)與配體競(jìng)爭(zhēng)顆粒表面上的空間，因此最大的配體吸附需要使用超純?cè)噭��?如果雜質(zhì)的濃度很高，則可能成為主要涂層。
2. 強(qiáng)制吸附：使用沉淀劑將配體“強(qiáng)制沉淀”到微球表面上的吸附，從而避免了對(duì)高度純化的配體的需要。
​A. 不同聚合物對(duì)吸附效率的影響
大配體在疏水表面上的吸附，發(fā)現(xiàn)在用于連接的相同緩沖液中稀釋基本上是不可逆的。但是，吸附的配體可被競(jìng)爭(zhēng)分子（例如蛋白質(zhì)或表面活性劑）置換。 疏水性聚合物的組成影響吸附的配體被置換的能力，從聚合物微球置換的順序是：
PS/PAA>PMMA>PS/PMMA>PS
還已經(jīng)表明，在溶液中存在競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)的情況下，蛋白質(zhì)置換的難易程度是蛋白質(zhì)組成的函數(shù)。 測(cè)試了三種代表性蛋白質(zhì)在上述每種聚合物上的置換難易性，每種聚合物的置換順序?yàn)椋?br /> 纖維蛋白原>免疫球蛋白>白蛋白
吸附的單克隆抗體在上面列出的共聚物上比在純聚苯乙烯上保留更多的生物學(xué)活性，這說(shuō)明吸附的蛋白容易置換和活性保留之間存在直接關(guān)系。 吸附蛋白的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致置換難易程度降低，也有可能導(dǎo)致活性降低。換句話說(shuō)，蛋白質(zhì)與疏水表面相互作用的任何機(jī)會(huì)都可能導(dǎo)致其折疊結(jié)構(gòu)的松弛，并具有熵的增加。 聚合物將決定這種結(jié)構(gòu)松弛的程度。
B. 不同蛋白質(zhì)對(duì)吸附效率的影響
通過(guò)研究各種蛋白質(zhì)在聚苯乙烯表面上的吸附效率，可以開發(fā)出吸附蛋白質(zhì)混合物的方案。 這在開發(fā)固相免疫測(cè)定法以檢測(cè)純蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)混合物時(shí)起著重要作用。
有一項(xiàng)這樣的研究，在開發(fā)使用蛋白質(zhì)混合物的吸附方案時(shí)，將獨(dú)立區(qū)域定義為需要考慮的重要變量。 獨(dú)立性區(qū)域可以定義為添加蛋白質(zhì)的濃度范圍，在該濃度范圍內(nèi)達(dá)到表面飽和，并且進(jìn)一步的結(jié)合可以忽略不計(jì)。 通過(guò)使添加蛋白質(zhì)的總濃度保持在此獨(dú)立區(qū)域內(nèi)，可以幫助確保每種蛋白質(zhì)的最大結(jié)合效率。 找到這個(gè)獨(dú)立區(qū)域的依據(jù)是：要吸附的蛋白質(zhì)的大小和在很小程度上的電荷，以及它們要吸附的微球的表面積。
C. 計(jì)算達(dá)到表面飽和度的微球/蛋白質(zhì)比率
大多數(shù)吸附應(yīng)用都是從與微球結(jié)合的單層蛋白質(zhì)開始的。 為了確保正確的空間方向并減少非特異性結(jié)合的可能性，我們建議添加蛋白質(zhì)的量要比計(jì)算出的單層高3-10倍。 但是，某些應(yīng)用程序（例如乳膠凝集測(cè)試）似乎在單層覆蓋范圍內(nèi)效果最好。 該單層量可以從以下公式得出：
S = (6 / ρD)(C)
其中S =實(shí)現(xiàn)表面飽和所需的代表性蛋白質(zhì)的量（mg蛋白質(zhì)/ g微球），
C =給定蛋白質(zhì)的微球表面容量，其取決于待偶聯(lián)蛋白質(zhì)的大小和分子量（mg蛋白質(zhì)/聚合物表面積m²），
6 /ρD=給定直徑的微球的表面積/質(zhì)量（m² / g） （ρ=微球的密度，聚苯乙烯為1.05 g / cm³），以及
D =微球直徑，以微米為單位。
以牛血清白蛋白（BSA，MW 65kD）和牛IgG（BIgG，MW 150kD）為例。計(jì)算以及吸附方案中列出的試劑體積均基于平均直徑為1.0μm的微球。 因此，計(jì)算如下：
對(duì)于BSA：C〜3 mg / m²，因此：
S =（6 /ρD）（C）
=（6 / 1.05 g / cm³•1.0µm）（3 mg / m²）
約18 mg的BSA。
對(duì)于BIgG：C〜2.5 mg / m²，因此：
S =（6 /ρD）（C）
=（6 / 1.05 g / cm³•1.0µm）（2.5 mg / m²）
〜15 mg的BIgG。
通過(guò)將配體的分子量與BSA和IgG的分子量進(jìn)行比較，可以估算出其他配體的表面飽和度。
注意：對(duì)于非凝集測(cè)試，如果包被是抗體要結(jié)合的抗原，通常，固相上的抗原越多越好。 如果包被是IgG抗體（Ab），則隨后要結(jié)合的抗原必須具有進(jìn)入固相IgG結(jié)合位點(diǎn)的空間，并且可能不需要完全覆蓋。 一些有經(jīng)驗(yàn)的用戶報(bào)告說(shuō)，使用的Ab覆蓋大約一半的顆粒表面，是乳膠凝集測(cè)試的理想選擇。
單位換算
微球固體含量（重量）
10% solids       ~0.1 g/mL = 100 mg/mL
1% solids        ~0.01 g/mL = 10 mg/mL
0.1% solids       ~0.001 g/mL = 1 mg/mL
聚合物密度
PS          1.05 g/cm³
PMMA      1.19 g/cm³
量/線性轉(zhuǎn)換
10^-9 = nano-
10^-6 = micro-
10^-3 = milli-

步驟
被動(dòng)吸附
試劑：
1. 聚合微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 吸附緩沖液（蛋白質(zhì)pI或接近 的pH的低離子強(qiáng)度緩沖液）
3. 純化的配體
4. 儲(chǔ)存緩沖液（添加了0.01-0.1％封閉分子的吸附緩沖液）
程序：

1. 用吸附緩沖液將微球稀釋至1％的固體含量（10 mg / mL）。注意：盡管微球分散液的表面活性劑或清潔劑通常有時(shí)會(huì)干擾結(jié)合，但通常無(wú)需在使用前清洗微球。 如果需要清洗，可以通過(guò)離心，透析或離子交換等技術(shù)進(jìn)行清洗。
2. 在吸附緩沖液中溶解適量的純化配體（通過(guò)計(jì)算確定）。
3. 將微球懸浮液加入到適當(dāng)體積的溶解蛋白中，并輕輕混合1-2小時(shí)。注意：通過(guò)向蛋白質(zhì)中添加微球，可以最大程度地提高效率，并且更可能分布吸附。
4. 在不斷混合下，將懸浮液在4°C下孵育過(guò)夜。 注意：盡管絕大多數(shù)的配體吸附都非常迅速地發(fā)生，但是可以通過(guò)延長(zhǎng)溫育達(dá)到平衡來(lái)幫助實(shí)現(xiàn)正確的方向。 其他選擇是在室溫下孵育1-2小時(shí)，或在37°C下孵育15-30分鐘（如果配體不會(huì)受到高溫的不利影響）。
5. 離心，除去上清液，并將微球沉淀重懸于所需的存儲(chǔ)濃度（通常為10 mg / mL）中。 如果需要，可以在此處添加一個(gè)單獨(dú)的阻斷步驟。 注意：可以保存上清液以確定游離蛋白質(zhì)的量，從中可以間接定量吸附的蛋白質(zhì)的量。 確定溶液中游離蛋白含量的常用測(cè)定方法是BCA測(cè)定法（Pierce Chemical Company）。

共價(jià)偶聯(lián)到非功能化聚合物微球
盡管在許多情況下將疏水性配體吸附到聚合物微球上是有利的，但有時(shí)疏水性吸引力可能不足以抵抗許多分析過(guò)程中包括的溫育和洗滌步驟。 在其他情況下，所討論的抗體可能無(wú)法被吸附并仍然保留其免疫反應(yīng)性。 對(duì)這種情況的一種解決方案是修飾微球的表面，使共價(jià)偶聯(lián)成為一種選擇。 以下是可用于此類修飾的方法。
1. 一種實(shí)用且可重復(fù)的普通聚苯乙烯包被方法包括：將聚苯丙氨酸-賴氨酸吸附到聚苯乙烯微球上，然后用戊烷1、5-二甲基戊酸酯活化并偶聯(lián)所需的配體。聚苯丙氨酸具有兩個(gè)重要的作用條件。 首先，苯丙氨酸殘基與聚苯乙烯表面之間的強(qiáng)疏水相互作用產(chǎn)生了基本上不可逆的吸附。 其次，“反應(yīng)性”氨基的引入提供了一種通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化化學(xué)方法共價(jià)連接的方法。
2. 可以將配體直接衍生化并與非官能化的聚苯乙烯微球共價(jià)偶聯(lián)。