概述
基于 T 細胞的療法正在迅速發(fā)展成為許多癌癥的有效一線治療選擇。近年來， FDA 已經批準了幾種針對免疫檢查點的治療性抗體和小分子用于臨床，以補充和提高T 細胞的靶向性和有效性。這些免疫檢查點抑制劑的臨床前篩選需要強大的體外腫瘤模型來評估 T 細胞殺傷效率。但是，傳統(tǒng)的 2D 腫瘤模型通常缺乏生物學相關性和復雜性來預測體內或臨床結果。 3D 生物打印平臺以及許多其他 3D 培養(yǎng)方法，提供了在生理上更相關的組織模型中自動篩選各種分子和藥物的潛力。在此，在此概念驗證研究中，我們描述了小鼠肺癌的同系生物打印腫瘤模型，以在細胞細胞毒性測定中評估免疫檢查點抑制劑（PD-1）。在生物印記的腫瘤中觀察到 T 細胞濃度依賴性殺傷， 并且添加免疫檢查點抗體進一步增強了 T 細胞殺傷效力。有人建議，生物打印的 T 細胞細胞毒性測定法可能使研究人員能夠在更有效的轉化模型中篩選檢查點抑制劑。

引言
T 淋巴細胞（T 細胞）在實現(xiàn)對傳染病和癌癥的長期免疫中起著至關重要的作用。 T 細胞可以在感染或癌細胞表面上的主要組織相容性復合物（MHC）分子的背景下識別特定抗原。這種特異性識別導致 T 細胞分泌有毒顆粒，從而特異性殺死靶細胞。傳統(tǒng)上，已經使用在二維（2D）單層中生長的靶細胞進行了 T 細胞殺傷（細胞毒性）測定（Golstein，2018）。這些 2D 分析可通過成像或其他方式快速輕松地進行終點分析。但是，在人體內部，T 細胞介導的靶細胞殺傷發(fā)生在三維（3D）環(huán)境中，這歸因于 T 細胞遷移或滲入 3D 組織核心的其他障礙。因此，3D T 細胞細胞毒性測定法在生理上更相關，并被認為可以更好地預測體內實驗的結果。在免疫刺激劑的臨床試驗中，使用三維腫瘤模型進行細胞毒性試驗越來越受到關注。

檢查點阻斷療法的最新發(fā)展徹底改變了癌癥治療領域，通過抑制免疫檢查點來增強 T 細胞介導的腫瘤細胞殺傷（Topalian，2016）。幾種檢查點抑制劑，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗體，已被批準用于臨床（Sharon，2014 年）。然而，開發(fā)高通量 T 細胞毒性測定法以快速和低成本地篩選此類抑制劑的需求仍然沒有得到滿足。

已經研究了幾種 3D 腫瘤模型，包括球狀體、懸滴和微流控芯片模型，用于 T 細胞細胞毒性測定。 例如，膠原蛋白-纖維蛋白凝膠用于在 3D 環(huán)境中生長癌細胞，以確定殺死所有癌細胞所需的 T 細胞的絕對濃度（Budhu，2010）。最近，微流體球體培養(yǎng)用于免疫檢查點封鎖的體外分析（Jenkins，2018）。 盡管這些模型在模仿體內環(huán)境的某些方面顯示出希望，但它們通常通量低或無法考慮細胞外基質（ECM）在腫瘤生物學中的關鍵作用。

生物打印是一項新興技術，使研究人員能夠自動化制造腫瘤構建體以篩選抗癌藥或免疫刺激劑。該技術沉積了一種充滿細胞的 ECM 材料（通常稱為生物墨水），與腫瘤細胞混合，隨后進行化學或熱固化，從而為打印結構提供機械強度。在這里，我們探索了3D T 細胞細胞毒性測定法的生物打印技術的潛力，以幫助評估免疫檢查點抑制劑。
 
材料和方法
細胞準備
為該項目選擇了小鼠肺癌細胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 細胞。兩種細胞類型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌細胞（LLC-1）從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）獲得，并根據建議的方案進行培養(yǎng)，每 3 至 4 天傳代一次。 為了促進活腫瘤細胞的成像，將編碼紅色熒光蛋白（RFP）的質粒引入 LLC-1 細胞，以生成穩(wěn)定的 LLC-RFP 細胞。LLC-RFP 細胞（此后稱為“LLC-1”）用于其余實驗。按照先前發(fā)布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培養(yǎng) OT-1 脾細胞并將其灌注 5 天。 在第 5 天的共培養(yǎng)研究中，未經進一步純化就使用了引發(fā)的細胞毒性 T 淋巴細胞（CTL）。
 
生物墨水的制備和生物打印
中和膠原蛋白 I（CELLINK），并與每毫升膠原蛋白中的 106LLC-1 細胞混合。將所有組件（包括注射器，針頭和針尖）置于冰上，直至準備使用。將溫度控制的打印頭（TCPH）設置為 8°C，而將打印床設置為 10°C。使用 BIO X（軟件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中對三維 LLC-1 腫瘤進行生物打�。ㄒ妶D 1）。印刷后，將 96 孔板轉移到 37°C 的恒溫培養(yǎng)箱中 20 分鐘，以使膠原蛋白聚合。接下來，將 200 µL DMEM 培養(yǎng)基添加到每個孔中。 媒體每 3 天刷新一次。 腫瘤生長 5 天，然后與 T 細胞共培養(yǎng)。

 

圖 1. 腫瘤的三維（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用膠原蛋白對 Lewis 肺癌細胞（LLC-1）進行膠原蛋白印刷。將膠原蛋白液滴（腫瘤）熱固化并在 DMEM 培養(yǎng)基中保持 5 天，然后再與 T 細胞共培養(yǎng)。

 
在第 4 天，將打印的腫瘤與 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小時，以使腫瘤細胞表達相關抗原。 在第 5 天， 洗滌打印的腫瘤， 并以不同的效應子與靶標（ E∶T） 比（0∶5）與 T 細胞共培養(yǎng) 48 小時。對于陽性對照，將腫瘤與依托泊苷或 TNFα孵育以誘導細胞凋亡引起的細胞死亡。 陰性對照孔未接受任何 T 細胞或凋亡誘導劑。對于抗原特異性，少數（n = 8）孔中的腫瘤未用 SIINFEKL 治療，但接受了引發(fā)的 T 細胞。

為了進行免疫檢查點分析， 將引發(fā)的 T 細胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗體（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）預處理 1 小時，然后將其加入與腫瘤的共培養(yǎng)物中（n = 8）。保留 IgG 同種型對照用于比較。
 
影像和統(tǒng)計
如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 熒光的損失被用作腫瘤細胞死亡的讀數。 使用 EVOS Auto 2 熒光顯微鏡進行成像。 使用 ImageJ 軟件（NIH）測量熒光強度，并使用 Graphpad Prism 8 進行圖形翻譯和制備。通過使用學生的 t 檢驗在 Prism 中對統(tǒng)計結果進行統(tǒng)計，數據表示為平均值±SEM。

結果與討論
腫瘤細胞生長和球狀體形成
BIO X 上的液滴功能能夠自動將穩(wěn)定的膠原蛋白腫瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形狀和孔位置的均勻性有助于整個顯微鏡和分析工作流程。 對打印的腫瘤進行 RFP 熒光成像，并用 Calcein AM 染色以確定細胞活力。 圖 2 中顯示的結果表明，LLC-1 細胞在第5 天在打印的腫瘤中是可行的。此外，這些細胞被限制在膠原蛋白內，而不是逃逸其結構以在 2D 表面上生長。
 

 

圖 2. 腫瘤細胞的生長和生存力。 對打印的腫瘤進行 RFP 熒光成像，并用鈣黃綠素 AM 染色以確定 T 細胞篩選前第 5 天的細胞活力。
 
3D 中的 T 細胞細胞毒性測定
T 細胞介導的細胞毒性被定量和定性驗證。 當將腫瘤與 T 細胞共培養(yǎng)時，觀察到腫瘤細胞活力的 T 細胞濃度依賴性降低（見圖 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，與無 CTL 對照相比，觀察到了腫瘤生存力的統(tǒng)計學顯著降低（p=0.0003）（〜30％）。 在存在或不存在 T 細胞的情況下，打印腫瘤的代表性圖像顯示在圖 3B中，當在共培養(yǎng)物中存在 T 細胞時，RFP 熒光顯示出質的下降。T 細胞能夠附著在膠原屏障上并在 3D ECM 環(huán)境中與癌細胞相互作用。
 

 

圖 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的腫瘤模型進行 T 細胞細胞毒性測定。（A）觀察到 T 細胞濃度依賴性地降低了腫瘤細胞的活力，這是通過 RFP 熒光的喪失來確定的。 CTL 的數量代表每孔的總 CTL。 （B）顯示了在存在或不存在 T 細胞的情況下打印的腫瘤的代表性圖像。 使用相同的采集參數拍攝圖像。
 
免疫檢查點測定
為了擴大 T 細胞殺傷的效用或限制，將腫瘤與經抗 PD1 抗體預處理的初免 T 細胞以 5：1 的 E：T 比例共培養(yǎng)。如圖 4 所示，與同種型對照相比，使用抗 PD1 抗體阻斷 PD-1 / PD-L1 軸顯示出 T 細胞介導的腫瘤細胞殺傷的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 檢查點的阻滯，引發(fā)的 T 細胞能夠更有效地附著在膠原蛋白屏障上， 更有效地浸潤和殺死腫瘤細胞。
 

 

圖 4. 免疫檢查 （A）顯示了免疫檢查點阻斷測定的示意圖。 單克隆抗 PD1 抗體阻斷了 PD1 與 PD-L1 之間的相互作用，從而增強了 T 細胞對腫瘤細胞的殺傷力。（B）在 IgG 同種型對照或抗 PD1 抗體存在下，將 3D 生物打印的腫瘤細胞與初免化的 T 細胞以 5：1 的 E：T 比例共培養(yǎng)。 PD1 阻斷顯示出對靶細胞的增強殺傷作用。