生物組織的高分辨率3D熒光成像在亞細(xì)胞、細(xì)胞和組織水平上為基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞在組織中的分布研究搭建了橋梁。組織透明化方法將生物組織透明，并結(jié)合最新的3D熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了組織結(jié)構(gòu)可視化。

盡管這種結(jié)合有諸多好處，但在3D組織成像應(yīng)用中仍存在挑戰(zhàn)：(1)在對(duì)厘米級(jí)樣本進(jìn)行微米級(jí)或更高分辨率成像時(shí)，傳統(tǒng)光片顯微鏡成像效率不高；(2)傳統(tǒng)光片顯微鏡難以兼容所有的組織透明化方法透明的樣本；(3)不能實(shí)時(shí)校正由不同成像液的折射率變化引起的偏差，優(yōu)化不同樣品的成像性能；（4）顯微鏡儀器校準(zhǔn)程序復(fù)雜且較為困難。2020年11月3日，西湖大學(xué)高亮實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在Cell Reports上發(fā)表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介紹了一款具有半自動(dòng)校準(zhǔn)能力的多功能平鋪光片顯微鏡，它能夠?qū)λ�有組織透明化方法透明的樣本組織進(jìn)行多色快速3D成像，并且成像的空間分辨率達(dá)微米級(jí)（4×4×10μm³）甚至亞微米級(jí)（0.3×0.3×1μm³）。另外，通過(guò)組織膨脹技術(shù)，平鋪光片顯微鏡的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm³）。

文章指出，平鋪光片技術(shù)很好地解決了上述問題。不同于其他的光片顯微鏡，平鋪光片顯微鏡不僅在透明化大組織樣本的3D成像上呈現(xiàn)更好的效果，而且可以大范圍內(nèi)更加簡(jiǎn)單的優(yōu)化和調(diào)節(jié)成像品質(zhì)，可以更方便的應(yīng)用在不同領(lǐng)域。

那么，與其他的光片顯微鏡相比，平鋪光片顯微鏡有哪些特點(diǎn)呢？
1） 和傳統(tǒng)的光片顯微鏡相比，相同的成像時(shí)間里，采用平鋪光片顯微鏡成像樣本可提高空間分辨率以及成像效率。
2）通過(guò)變換不同NA的檢測(cè)物鏡，放大倍數(shù)，以及調(diào)整激發(fā)光片，平鋪光片顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)對(duì)厘米級(jí)的組織樣本進(jìn)行從微米級(jí)到亞微米級(jí)空間分辨率的成像，而利用組織膨脹技術(shù)可以進(jìn)一步提高成像分辨率。
3）通過(guò)空間光調(diào)制器對(duì)激發(fā)光片進(jìn)行相位調(diào)制，用于創(chuàng)建和優(yōu)化樣品照明的平鋪光片。
4）顯微鏡具有半自動(dòng)校準(zhǔn)功能，保證了成像的準(zhǔn)確性、可靠性和易用性；
5）顯微鏡與所有的組織透明化方法兼容，適用于不同形狀，不同機(jī)械強(qiáng)度的組織成像。
6）不同的透明化組織樣本可以在幾分鐘內(nèi)快速更換成像；
7）可以對(duì)透明化組織進(jìn)行多分辨率級(jí)別、各向同性、多色三維成像；
憑借上述優(yōu)點(diǎn)，平鋪光片顯微鏡對(duì)組織樣本進(jìn)行3D成像的結(jié)果又如何呢？

1）實(shí)現(xiàn)微米級(jí)空間分辨率的3D組織成像
具有近乎各向同性的微米級(jí)空間分辨率的3D組織成像非常適合在細(xì)胞水平上可視化組織結(jié)構(gòu)。如圖1所示，3小時(shí)內(nèi)獲取的小鼠腦血管網(wǎng)絡(luò)展示了識(shí)別到的幾乎所有的毛細(xì)血管。成像結(jié)果可對(duì)腦血管結(jié)構(gòu)提供清晰的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)闡釋。根據(jù)成像結(jié)果提取到的數(shù)據(jù)顯示大腦皮層中這些穿透性的血管可通過(guò)毛細(xì)血管與位于胼胝體區(qū)域的海馬內(nèi)小靜脈或小動(dòng)脈相連接。因此，平鋪光片顯微鏡卓越的3D成像能力可以輔助了解整腦不同腦區(qū)的血管網(wǎng)絡(luò)分布。

 

2）多色3D組織成像能力
多色3D成像技術(shù)對(duì)研究組織內(nèi)部不同細(xì)胞器的相對(duì)分布有極大幫助。平鋪光片顯微鏡具有對(duì)所有波段的激發(fā)光進(jìn)行相位調(diào)制的功能，可以確保不同激發(fā)光束共線校正，從而確保不同顏色通道采集圖像的精確配準(zhǔn)。本文通過(guò)雙色標(biāo)記的小鼠乳腺成像來(lái)檢測(cè)顯微鏡的多色3D成像能力。圖2（A-Y）小鼠乳腺雙色成像結(jié)果表明可以清晰分辨位于乳腺管內(nèi)層的腔細(xì)胞，及乳腺管外層的基底細(xì)胞。這兩者的相對(duì)表達(dá)體現(xiàn)了乳腺導(dǎo)管和末端芽的不同分布模式，結(jié)果表明了乳腺細(xì)胞組成的空間異質(zhì)性。
圖2（Z-GG）展示了對(duì)人類的乳腺癌組織和相鄰的正常乳腺組織進(jìn)行成像。從實(shí)驗(yàn)表達(dá)結(jié)果可以看出，腫瘤組織失去了原有腺泡結(jié)構(gòu)僅有異常的管狀結(jié)構(gòu)，并顯示出具有利于癌細(xì)胞浸潤(rùn)的密集血管脈絡(luò)系統(tǒng)。該患者的淋巴結(jié)腫大并伴有可疑的浸潤(rùn)細(xì)胞，這與脈管系統(tǒng)異常的表征相符。該組實(shí)驗(yàn)表明組織透明化和高分辨率3D組織成像技術(shù)在病理學(xué)應(yīng)用中的價(jià)值。


3）亞微米級(jí)空間分辨率的3D組織成像
   為觀察亞細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，將平鋪光片顯微鏡的檢測(cè)物鏡提升至1.0NA，照明物鏡提升至0.28NA，產(chǎn)生1um薄光片對(duì)樣本進(jìn)行成像。如圖3所示，成像結(jié)果呈現(xiàn)出高倍顯微鏡具有很好的亞細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的分辨能力，我們可以觀察到興奮性錐體神經(jīng)元、神經(jīng)元軸突上清晰可辨的樹突棘和單個(gè)神經(jīng)元的形態(tài)。


4）組織膨脹的亞微米級(jí)空間分辨率的3D組織成像
組織膨脹技術(shù)提供了一種比顯微鏡更高的空間分辨率來(lái)分辨組織結(jié)構(gòu)的解決方案。實(shí)驗(yàn)研究了平鋪光片顯微鏡與組織膨脹技術(shù)結(jié)合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠腦透明化使用組織膨大技術(shù)將樣本各向同性擴(kuò)大5倍，成像空間分辨率為2um×2um×5um，那么同等的空間分辨率根據(jù)5倍膨脹比例，映射到對(duì)實(shí)際樣本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像結(jié)果如圖4所示，小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞和亞細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰可見，盡管海馬區(qū)細(xì)胞密度較高，依舊可以分解出單個(gè)神經(jīng)元軸突和樹突棘。同時(shí)，如圖4虛線框內(nèi)標(biāo)識(shí)可以觀察到一些神經(jīng)軸突的神經(jīng)間的軸漿運(yùn)輸。

 
5) 用組織膨脹技術(shù)實(shí)現(xiàn)100nm以下空間分辨率的3D組織成像
平鋪光片顯微鏡通過(guò)采用更高NA的檢測(cè)物鏡和更薄的光片對(duì)膨脹組織成像，能夠達(dá)到100nm以下的空間分辨率，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析。
圖5采用0.8NA的檢測(cè)物鏡以及更薄的激發(fā)光片展示了更精細(xì)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，納米尺度空間分辨率的3D成像對(duì)完全解析大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是非常必要的。

  6) 具有多分辨率尺度的三維組織成像
  平鋪光片顯微鏡的優(yōu)勢(shì)是可以為其他生物組織的研究提供幫助。圖6展示了平鋪光片顯微鏡對(duì)透明化的真渦蟲以從微米到亞微米多種空間分辨率成像的結(jié)果。整體成像結(jié)果展示了干細(xì)胞在真渦蟲內(nèi)的整體分布，局部高空間分辨率成像結(jié)果展示了真渦蟲內(nèi)干細(xì)胞組織以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。因此，平鋪光片顯微鏡可以更好地研究真渦蟲干細(xì)胞的分布和功能。類似的優(yōu)點(diǎn)同樣適用于其他生物研究，例如秀麗隱桿線蟲，黑腹果蠅，斑馬魚等。

 
 
結(jié)論
綜上所述，本文開發(fā)了一款多功能平鋪光片顯微鏡，具有卓越的多色3D成像能力，能夠以微米級(jí)至100nm以下的空間分辨率對(duì)厘米級(jí)的透明化樣本組織進(jìn)行快速3D成像。該顯微鏡兼容所有的組織透明化方法，靈活適應(yīng)不同的應(yīng)用。它還具有通過(guò)相位調(diào)制實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)的能力，操作簡(jiǎn)單可靠。因此，平鋪光片顯微鏡使得3D透明化組織成像在生物醫(yī)學(xué)研究中更加可靠及可行。
 
上述平鋪光片技術(shù)已由锘海生命科學(xué)商業(yè)化——NuohaiLS18平鋪光片顯微鏡，同時(shí)，我們依托LS18光片顯微鏡搭建了锘海生命科學(xué)一站式服務(wù)平臺(tái)，為廣大客戶提供專業(yè)的生物組織透明化、免疫染色、平鋪光片顯微鏡3D熒光成像、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等一站式科研服務(wù)，旨在通過(guò)精準(zhǔn)、快速、多樣化的科研服務(wù)為每一位生命科學(xué)工作者提供個(gè)體化/定制化的解決方案。
 
文獻(xiàn)鏈接：:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108349