之前說(shuō)到光片顯微鏡以其較高的三維空間分辨率、良好的光學(xué)切片能力和較高的成像速度而備受關(guān)注。但是由于衍射極限導(dǎo)致的光片形狀限制（見(jiàn)光片技術(shù)小課堂二2.1），當(dāng)需要大視場(chǎng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致較低的軸向分辨率或較差的光學(xué)切片能力。因此，如何產(chǎn)生出厚度均勻且薄，又大到能覆蓋視場(chǎng)的激發(fā)光片成為光片顯微鏡的關(guān)鍵問(wèn)題。目前已經(jīng)有很多不同的方法來(lái)嘗試在光片顯微鏡中產(chǎn)生這樣的光片，例如高斯光片、貝塞爾光片和晶格光片。然而無(wú)論采用何種方法，這種光片自身特性的相互限制對(duì)所有類型的光片都是存在的，而且當(dāng)我們需要用亞微米厚度的光片去對(duì)幾十微米或更大的視場(chǎng)進(jìn)行成像時(shí)，這個(gè)問(wèn)題尤其具有挑戰(zhàn)性。
 
Dean和Fiolka首先提出了一種解決方案，通過(guò)使用聚焦可調(diào)的透鏡沿光的傳播方向掃描激發(fā)光的焦點(diǎn)，從而可以創(chuàng)建長(zhǎng)而均勻的虛擬激發(fā)光束，并且可以通過(guò)掃描虛擬激發(fā)光束進(jìn)一步生成大而均勻的虛擬激發(fā)光片。但是這種方法有兩個(gè)局限性，第一是由于掃描過(guò)程中激發(fā)光束尾跡的混合使得用這種方法產(chǎn)生的光片對(duì)激發(fā)光的限制很差，因此光學(xué)切片的能力較差，必須與共焦檢測(cè)一起使用以抑制熒光背景；其次，由于產(chǎn)生的激發(fā)光片是一個(gè)虛擬光片，因此在一個(gè)相機(jī)曝光周期內(nèi)，焦點(diǎn)必須掃描整個(gè)視場(chǎng)，因此在視場(chǎng)內(nèi)任何特定位置的實(shí)際曝光時(shí)間都非常短，必須使用相對(duì)較高的激發(fā)功率才能產(chǎn)生足夠的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致更強(qiáng)的光毒效應(yīng)。

 


在這之后，西湖大學(xué)的高亮博士提出了一種在不增加光片厚度或降低光約束力的情況下提高光片顯微鏡視場(chǎng)的替代方案。如圖1所示，可以通過(guò)沿光片長(zhǎng)度方向在檢測(cè)光路的焦平面內(nèi)平鋪光片并在每個(gè)位置拍攝圖像來(lái)代替使用較大的激發(fā)光片對(duì)大視場(chǎng)進(jìn)行成像。然后，將所有圖像組合在一起，重建整個(gè)視場(chǎng)的圖像。盡管這種方法降低了成像速度，但其所帶來(lái)的好處是顯而易見(jiàn)的，采用更薄的光約束能力越好的光片對(duì)同一樣品進(jìn)行成像，可以獲得更高的軸向分辨率和更好的光學(xué)切片能力。

 
圖1 該圖展示了該方法的工作原理，同樣的視野可以通過(guò)沿著光片長(zhǎng)度方向平鋪更小但更薄的光片并拍攝額外的圖像來(lái)成像。
 
為了在實(shí)際中實(shí)現(xiàn)這一方法，在成像過(guò)程中樣品或激發(fā)光束必須沿光束方向快速移動(dòng)。高亮博士選擇通過(guò)使用純相位空間光調(diào)制器（spatial light modulate, SLM）對(duì)光束進(jìn)行離焦來(lái)移動(dòng)激發(fā)光束，因?yàn)闊o(wú)論是移動(dòng)樣品還是激發(fā)物鏡都太慢。此外由于光片顯微鏡中激發(fā)物鏡和檢測(cè)物鏡之間的物理約束，激發(fā)物鏡的NA通常小于0.6，因此激發(fā)光束可以在對(duì)其橫向光強(qiáng)分布影響很小的情況下離焦幾百微米。

接下去高亮博士在前期嚴(yán)格的數(shù)字模擬后通過(guò)兩個(gè)實(shí)際成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法的可行性，首先
是用1.5%瓊脂糖凝膠包埋100nm黃綠色熒光粒子來(lái)驗(yàn)證該方法的成像性能，結(jié)果如下：圖2(a) – 2(c)展示了在三個(gè)不同激發(fā)光束位置（左、中、右）下為同一視場(chǎng)采集的三個(gè)三維圖像堆棧的軸向最大值投影；圖2(d) – 2(f)展示了相應(yīng)的去卷積圖像結(jié)果；圖2(h) – 2(m)展示了選定的相同熒光粒子在去卷積前后的高分辨率對(duì)比視圖，以及每個(gè)選定粒子的軸向強(qiáng)度圖。


 
圖2 用平鋪光片方法對(duì)嵌入瓊脂糖凝膠中的熒光粒子進(jìn)行三維成像。(a-c) 在激發(fā)光片分別位于視場(chǎng)的左側(cè)(a）、中間(b)和右側(cè)(c)時(shí)的同一視場(chǎng)下的YZ最大值投影；(d-f) YZ去卷積后的最大值投影；(h-m) 同一視場(chǎng)不同區(qū)域中所選熒光粒子的放大視圖與軸向強(qiáng)度圖；比例尺：a為5µm，h為1µm。
 

如圖2所示，在每個(gè)光束位置由于與視場(chǎng)相比激發(fā)光束長(zhǎng)度更短，因此在相應(yīng)的子區(qū)域中獲得了比其余區(qū)域更高的軸向分辨率，通過(guò)在三個(gè)位置平鋪激發(fā)光片，可以在整個(gè)視場(chǎng)內(nèi)獲得~500nm的均勻軸向分辨率。
 
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)在3折疊期的活體線蟲(chóng)胚胎成像進(jìn)一步證明了其成像性能。在這個(gè)階段，胚胎內(nèi)大約有550個(gè)細(xì)胞，這種胚胎的細(xì)胞結(jié)構(gòu)非常致密，它會(huì)引起強(qiáng)烈的光學(xué)像差和散射。為了獲得具有亞微米軸向分辨率和高信噪比的三維圖像，需要具有良好的光學(xué)切片能力。在三個(gè)位置之間移動(dòng)相同的激發(fā)光束以成像整個(gè)胚胎，胚胎的橫向最大值投影如圖3(a)所示。為了更好地揭示胚胎的內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)，圖3(b) – 7(d)展示了在不同光束位置下沿水平虛線的胚胎截面圖，圖3(e) – 3(g)展示了沿三條垂直虛線的胚胎截面圖。盡管胚胎的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，光學(xué)像差大，但由于使用了具有良好光約束力的薄激發(fā)光束，通過(guò)移動(dòng)激發(fā)光束并拍攝額外的圖像，整個(gè)胚胎能夠如預(yù)期那樣以~500nm的軸向分辨率和高信噪比成像。


圖3 用平鋪光片方法對(duì)3折疊期線蟲(chóng)胚胎進(jìn)行了三維成像。(a) 胚胎XY最大值投影；(b-d) 在激發(fā)光片位于胚胎的左側(cè)(b)、中間(c)和右側(cè)(d)時(shí)胚胎沿(a)所示水平線的YZ截面圖；(e-g) 沿(a)所示三條垂直線處的胚胎XZ截面圖。比例尺：a為5µm，b和e為2µm。
 
高亮博士在該研究中提出并展示了一種新的使用光片顯微鏡進(jìn)行的三維成像方法，能夠在獲得高三維空間分辨率和良好的光學(xué)切片能力的同時(shí)獲得大視場(chǎng)。與以前實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的解決方案相比，它沒(méi)有試圖擴(kuò)展光片的尺寸至足夠覆蓋整個(gè)視場(chǎng)，而是通過(guò)使激發(fā)光束離焦并拍攝同一圖像平面的多個(gè)圖像，將相對(duì)較小的激發(fā)光片平鋪到多個(gè)位置。通過(guò)這個(gè)方法，在只降低成像速度的情況下能獲得具有更薄厚度和更好的光約束力的光片。高亮博士提出的方法是很有價(jià)值的，首先，盡管已經(jīng)引入了不同種類的光片來(lái)提供對(duì)該問(wèn)題的解決方案，但這些方案無(wú)論是使用什么方法產(chǎn)生的激發(fā)光片，仍普遍是將光片變得更厚或者增加光片的尺寸導(dǎo)致光約束力（即光學(xué)層切能力）變得更差，這樣的思路由于光的衍射極限的限制，不可能有完美的解決方案。因此，該方法是在軸向分辨率、光學(xué)切片能力和視場(chǎng)均不受影響的前提下，提供的一種新的策略。其次，所提出的方法對(duì)任何類型的光片顯微鏡都是有效的，這意味著使用同一種尺寸較小、厚度較薄且光約束能力較好的光片，可以從同一樣品中獲得更高的軸向分辨率和更好的光學(xué)切片能力。锘海LS18平鋪光片顯微鏡正是使用了這一優(yōu)秀且巧妙的技術(shù)作為產(chǎn)品的核心技術(shù)，旨在為廣大生命科學(xué)研究者提供更好更優(yōu)秀的成像工具及成像技術(shù)。
 
 
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