圖1：麥葉上的蚜蟲
 

適合于電子顯微鏡的環(huán)境

電子顯微鏡的樣品室通過(guò)抽真空處理降至極低壓力。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無(wú)法有效保全結(jié)構(gòu)，因?yàn)榧?xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會(huì)快速蒸發(fā)。

生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存，這樣后續(xù)脫水對(duì)原位結(jié)構(gòu)的破壞最小，同時(shí)可以使用環(huán)境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的唯一方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變?yōu)榱�邊形冰時(shí)體積會(huì)增加）而是無(wú)定形冰，因此體積保持不變。所以，對(duì)滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留（見文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹”）。

要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu)，冷凍斷裂是唯一的方法。通過(guò)刀片（或類似物）或釋放彈簧負(fù)載的外力來(lái)破開冷凍樣本，并沿著最小阻力線斷裂樣本。

圖2：冷凍斷裂（來(lái)源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity）
 

水的升華與凝結(jié) – 冷凍蝕刻與污染

要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除。這就需要通過(guò)把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu)。升華的過(guò)程是冰不經(jīng)過(guò)液態(tài)過(guò)程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。而液態(tài)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞。

圖3：ES，細(xì)胞外表面；PF，細(xì)胞膜冷凍斷裂面；EF，細(xì)胞膜外層冷凍斷裂面；FS，細(xì)胞膜內(nèi)表面；Cyt，細(xì)胞質(zhì)
 

水的升華/冷凝過(guò)程取決于特定溫度下的飽和壓力，以及水或冰在室內(nèi)的有效水分壓。

注意：良好的真空度會(huì)降低水分壓。

例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個(gè)壓力，則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài)。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量。在更高壓力下，冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會(huì)在樣本表面上生長(zhǎng)。必須采取一切手段來(lái)避免這種情況。樣本上方一個(gè)較冷（比樣本更冷）的冷阱會(huì)降低局部壓力，從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上。在低于飽和壓力的壓力下，更多的分子升華而不是冷凝，同時(shí)會(huì)發(fā)生冷凍蝕刻。

執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本完全無(wú)冰，這一過(guò)程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時(shí)間內(nèi)執(zhí)行的小樣本。該過(guò)程分為幾個(gè)步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃，同時(shí)在每個(gè)步驟上使溫度保持一定時(shí)間。該過(guò)程需要幾天的時(shí)間來(lái)完成。

圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）
 

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