ROX是一種廣泛使用的惰性熒光染料，通常添加到qPCR反應(yīng)液中以校正熒光信號(hào)。然而，隨著熒光技術(shù)在儀器中的發(fā)展，比如在Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，為了標(biāo)準(zhǔn)化而單獨(dú)使用染料的步驟已不再需要。當(dāng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)首次引入市場(chǎng)時(shí)，許多產(chǎn)品使用固定光源和檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)96孔整板進(jìn)行同時(shí)成像，導(dǎo)致熱塊中每個(gè)孔的光路不同（圖1）。光程差異將導(dǎo)致每個(gè)孔的絕對(duì)熒光測(cè)量值發(fā)生變化，這取決于它們?cè)诎迳系奈恢�。例如，具有較短光程的孔可能比具有較長(zhǎng)光程的孔具有更高的熒光讀數(shù)，從而導(dǎo)致兩孔之間的熒光值偏差增大。因此，許多研究者開(kāi)始使用參考染料（如ROX）對(duì)這種信號(hào)變化進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。
 

Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR的光學(xué)系統(tǒng)

由圖1可知，在傳統(tǒng)實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)的全板成像中，與角落的孔相比，中心區(qū)域的孔可以檢測(cè)到更高的熒光信號(hào)。由于ROX信號(hào)不受qPCR反應(yīng)的影響，只要qPCR混合液的屬性保持不變，那么它在整個(gè)qPCR過(guò)程中也會(huì)保持穩(wěn)定。基于這個(gè)原因以及ROX更優(yōu)越的光譜特性，ROX被視為一個(gè)很好的參考染料，可用于熒光信號(hào)的歸一化處理，以校準(zhǔn)光程差引起的熒光變化。但是ROX作為參考染料的挑戰(zhàn)在于，它占用了一個(gè)可能用于檢測(cè)靶標(biāo)的熒光通道。隨著流感病毒和COVID-19新冠病毒（參照ANDiS SARS-CoV-2 and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit）等應(yīng)用變得越來(lái)越普遍，多重反應(yīng)也越來(lái)越常規(guī)，這也說(shuō)明了多通道檢測(cè)的重要性。

Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)采用新型的高性能光學(xué)系統(tǒng)，在qPCR實(shí)驗(yàn)中無(wú)需ROX校準(zhǔn)。該光學(xué)系統(tǒng)采用16組光纖單孔掃描設(shè)計(jì)，一根光纖用于高能LED激發(fā)，另一根用于光信號(hào)檢測(cè)，可16孔同時(shí)采集，確保數(shù)據(jù)采集的一致性（圖2）。此外采用“全孔檢測(cè)”技術(shù)，每個(gè)孔可采集大約100,000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)取讀數(shù)的平均值，精準(zhǔn)測(cè)定每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度（圖3）。這種“全孔檢測(cè)”為每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)提供了比單孔掃描系統(tǒng)更具重現(xiàn)性和可靠性的數(shù)據(jù)，因?yàn)閱慰讙呙柘到y(tǒng)僅僅采集少量的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

應(yīng)用實(shí)例：

1、方法：

配制20µl反應(yīng)體系，在Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行10個(gè)重復(fù)孔的qPCR擴(kuò)增。

2、結(jié)果與討論：

結(jié)果表明，Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)能很好地檢測(cè)到每個(gè)qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖4可知，10個(gè)重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線高度一致，說(shuō)明所有孔檢測(cè)到的信號(hào)均勻增加；計(jì)算得出Cq平均值為17.54，標(biāo)準(zhǔn)偏差低至0.02。Cq值的變異系數(shù)（CV）為0.13%，也反映了數(shù)據(jù)的高精準(zhǔn)度。

光纖檢測(cè)系統(tǒng)與Marlow-Peltier溫度模塊相結(jié)合，在qPCR實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了孔間信號(hào)檢測(cè)的均勻性和加熱溫度的均勻性，并且由于每個(gè)樣品都是單孔激發(fā)和掃描，因此避免了背景信號(hào)的干擾。通過(guò)10個(gè)重復(fù)反應(yīng)的低標(biāo)準(zhǔn)偏差和CV值進(jìn)一步證明了Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的產(chǎn)品特點(diǎn)，即可完全消除光程差，不需要使用ROX進(jìn)行均一化處理，Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)仍能獲得高精準(zhǔn)度的可靠數(shù)據(jù)。

Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Azure Cielo™ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來(lái)自于美國(guó)Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測(cè)通道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強(qiáng)度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號(hào)傳輸作為檢測(cè)系統(tǒng)，CMOS檢測(cè)靈敏度高，光纖傳輸速度快，無(wú)光損失和噪音干擾，無(wú)需ROX校準(zhǔn)。Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。