一文掌握MIQE指南的RT-qPCR發(fā)表數(shù)據(jù)的實用方法
▲圖1：RT-qPCR基本流程
1、實驗設計
正確的實驗設計是任何基因表達研究的關鍵。由于mRNA轉錄對與研究過程無關的外部刺激敏感，因此嚴格控制和設計實驗條件的工作是十分重要的。其中包括了確定實驗程序、對照組、重復組的類型和數(shù)量、實驗條件以及各組內(nèi)的樣品處理方法等，這些對于最小化變異性至關重要（表1）。
▲表1：RT-qPCR實驗設計和樣品管理
2、RNA提取及質(zhì)控
樣品需-80℃冷凍或使用RNA儲存溶液進行儲存。RNA提取程序應包括DNA酶處理步驟，以去除任何的基因組DNA污染。
確保僅使用高純度（無污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR實驗工作流程中最關鍵的一點。RNA樣本中的雜質(zhì)可能導致RT和PCR的抑制，從而導致不同和不正確的定量結果。由于樣品純度和完整性不相關，因此應評估兩者確定RNA樣本符合下游工作流程的最低驗收標準。
▲表2 ：核酸質(zhì)量控制方法概述
3、逆轉錄
考慮到RNA酶在環(huán)境中的普遍存在，建議在質(zhì)量控制評估后立即將總RNA樣本反轉錄成cDNA。這將避免RNA樣品在轉化為cDNA之前多次冷凍/解凍而降解的風險。對于RT步驟，關鍵是確保提取的RNA樣本中轉錄基因組的一致性和完整性。建議使用相同數(shù)量的總RNA，并保持所有實驗樣本的反轉錄反應時間，以最小化生物復制之間的變異性。
4、引物和擴增子設計
引物設計和靶序列的選擇是保證擴增產(chǎn)物特異性和高效性的關鍵。目前有許多軟件或在線網(wǎng)站可設計引物對和確定擴增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。
5、qPCR驗證
qPCR驗證是使用一組標準樣品對引物退火溫度、反應效率和特異性的適度范圍進行評估的方法。具體步驟如下：
1.根據(jù)儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑；
2.配置不同的PCR反應體系，凝膠電泳檢測引物適宜濃度以及特異性；
▲圖2：引物適宜濃度以及特異性測定
3.設置溫度梯度測試引物適宜退火溫度；
▲圖3：引物適宜退火溫度的測定
4.實驗設置NTC、NRC、POS和NEG等對照組，來監(jiān)控實驗體系或污染；
5.標準曲線的建立(評價PCR效率)。
▲圖4：標準曲線，圖源:Azure Cielo™ qPCR系統(tǒng)
6、內(nèi)參基因的選擇
在RT-qPCR實驗中，內(nèi)參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。一個好的內(nèi)參基因應在不同時空樣本或不同處理樣本中具有相對穩(wěn)定的表達水平，常見的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。
7、實驗重復性
基因表達實驗中有兩種可能影響結果的變異來源：
1.由于個體有機體、組織或細胞樣品之間基因表達水平的固有差異引起的生物變異性；
2.實驗過程本身的技術變異性，通常與移液器誤差、操作誤差或樣品質(zhì)量和數(shù)量有關。為了減輕生物和技術變異性的影響，一般認為至少三次生物學重復和技術重復。
▲圖5 ：實驗重復的設計
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