熒光顯微鏡是目前使用頻率很高的常用實(shí)驗(yàn)室儀器。如果優(yōu)化從光源到樣品表面的照明是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常碰到的問(wèn)題。廣州科適特科學(xué)儀器有限公司在給客戶服務(wù)過(guò)程中，根據(jù)客戶反饋和參考相關(guān)文獻(xiàn)，簡(jiǎn)要總結(jié)如何優(yōu)化顯微鏡熒光光源。當(dāng)來(lái)自顯微鏡熒光光源在通往顯微鏡的樣品表面可能出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可以在以下部位查找可能的故障原因。 顯微鏡熒光光源與倒置熒光顯微鏡的連接。虹色標(biāo)記的位置1-5對(duì)應(yīng)于后續(xù)表格中用于測(cè)量的光路中的位置。
 
近年來(lái)，越來(lái)越多的LED光源被用于熒光顯微鏡成像。這些LED光源的設(shè)計(jì)克服了汞燈和金屬鹵化物弧光燈的局限性，可提供令人優(yōu)越的性能，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了早期的照明光源。LED顯微鏡熒光光源具有高信噪比（SNR）和高分辨率，增強(qiáng)的靈敏度和穩(wěn)定性特點(diǎn)。可為熒光顯微鏡成像提供高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)具有更長(zhǎng)的使用壽命和更低的維護(hù)成本。

但是，要實(shí)現(xiàn)LED光源的這些優(yōu)點(diǎn)，必須將照明器的輸出有效的傳送到顯微鏡的樣品表面。我們可以研究一下顯微鏡熒光光源是如何傳遞到顯微鏡樣品表面的。光路分析不僅可以用于優(yōu)化照明效果，還可以用于解決照明中出現(xiàn)的問(wèn)題。

顯微鏡光源光路分析
當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)顯微鏡樣品平面的熒光激發(fā)亮度不夠，很容易就認(rèn)為光源有問(wèn)題，光強(qiáng)不夠。但通常不一定正確。因?yàn)閷?shí)際上，光路的所有中間組件都可能影響最終的樣品表面照明。解決這個(gè)問(wèn)題需要考慮所有將照明器輸出傳輸?shù)斤@微鏡的光學(xué)組件的情況（請(qǐng)參考下圖），這些配件最終都會(huì)影響整個(gè)顯微鏡的通光率。

該表對(duì)從顯微鏡熒光光源到顯微鏡樣品表面的光通量進(jìn)行了逐步分析。使用10倍物鏡（位置5A）在樣品平面上測(cè)得的光通量大概15–50 mW / mm²，基本在寬場(chǎng)熒光顯微鏡的需求范圍內(nèi)（1–100 mW / mm²）。下圖顯示了用來(lái)測(cè)試的光源到Nikon Ti顯微鏡樣品表的光通量。 對(duì)于熒光顯微鏡應(yīng)用，光源提供的輻照度在各波長(zhǎng)下是不一樣的。這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射光強(qiáng)度取決于可用于熒光團(tuán)吸收的光子數(shù)。對(duì)于相同的輻照度水平，光子數(shù)量隨波長(zhǎng)增加。因此，在其它條件不變的情況下，375 nm激發(fā)光下產(chǎn)生一定熒光強(qiáng)度所需的輻照度是750 nm（2×375 nm）所需的輻照度的兩倍。因此，在顯微鏡光源中通常紅色光譜區(qū)域具有較低的輻射通量水平（635/22 nm；請(qǐng)參閱表的最右列）。

盡管表中所示的輻射通量水平對(duì)于常規(guī)的寬視野熒光顯微鏡來(lái)說(shuō)是足夠使用的，但確實(shí)存在改進(jìn)的機(jī)會(huì)。此類改進(jìn)針對(duì)兩個(gè)主要應(yīng)用需求。首先，要在較短的時(shí)間間隔內(nèi)獲取更多圖像而又不影響信噪比，則需要來(lái)自光源的較高輻射度和較短的相機(jī)曝光時(shí)間。第二，許多用于提高寬視野熒光顯微鏡的空間分辨率的技術(shù)會(huì)增加光學(xué)濾片。由濾片引起的損耗必須通過(guò)增加光源的輸出來(lái)補(bǔ)償。

改進(jìn)方法探討

我們參考表中光路，簡(jiǎn)要地研究實(shí)現(xiàn)這些改進(jìn)的方法。
1. 激光光源：與本文舉例使用的LED熒光光源不同，采用固態(tài)二極管激光光源來(lái)提高輸出光功率。
2. 液體光導(dǎo)管。液體光導(dǎo)可以減少顯微鏡熒光光源引起顯微鏡振動(dòng)。它也可以使光源可以放在遠(yuǎn)離顯微鏡的位置，避免操作空間太擁擠。但是，液體光導(dǎo)管會(huì)降低顯微鏡熒光光源輸出，損耗35％到50％的光強(qiáng)。可以選擇較大直徑（例如5mm光導(dǎo)管代替3mm）的液體光導(dǎo)管提高輻照度，這通常需要重新設(shè)計(jì)顯微鏡光路以將增加的光強(qiáng)傳播到樣品平面。
3. 準(zhǔn)直鏡：與基于消色差透鏡的傳統(tǒng)設(shè)計(jì)相比，采用復(fù)眼透鏡的準(zhǔn)直儀可提供出色的光通量和空間均勻性。
4. 物鏡：在落射熒光顯微鏡中，熒光強(qiáng)度與物鏡數(shù)值孔徑（NA）相關(guān)，物鏡的數(shù)值孔徑越大，熒光強(qiáng)度也增加。因此，選擇大數(shù)值孔徑的物鏡，同時(shí)具有足夠的工作距離能夠獲得更好的熒光效果。
總體來(lái)說(shuō)，熒光顯微鏡的照明光源技術(shù)不斷在發(fā)展。傳統(tǒng)的弧光燈有很多缺點(diǎn)，包括它們含有有毒的汞蒸氣。LED光源由于光強(qiáng)的不斷改進(jìn)，已經(jīng)能夠滿足大部分熒光成像的要求。但是，按照上面介紹的分析步驟進(jìn)行操作，將有助于顯微鏡用戶理解光源與顯微鏡是如何一起工作的，并有助于找到光源及成像問(wèn)題的原因。

參考文獻(xiàn)
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