實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。由于其精準(zhǔn)度好、靈敏度高，在分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在基因表達(dá)差異分析方面。基因表達(dá)差異分析一般是比較不同時(shí)空樣本或不同處理樣本（藥物處理，物理處理和化學(xué)處理等）之間特定基因的表達(dá)差異。

當(dāng)檢測(cè)出某個(gè)基因的表達(dá)是上調(diào)或下調(diào)時(shí)，我們并不知道這種表達(dá)差異是源自于它本身表達(dá)量的變化，還是樣本量大小或者操作導(dǎo)致的RNA的損失等其他原因?qū)е卤磉_(dá)量的變化。為了減少實(shí)驗(yàn)偏差并產(chǎn)生準(zhǔn)確的表達(dá)水平，RT-qPCR往往需要考慮幾個(gè)變量（如操作誤差或RNA提取量、得率及變異等）進(jìn)行歸一化處理。目前，RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)化最常用的方法是使用內(nèi)參基因進(jìn)行均一化處理。

什么是內(nèi)參基因？

理想情況下，在所有發(fā)育階段和不同實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)中，內(nèi)參基因在不同組織的所有樣本中應(yīng)具有相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。內(nèi)參基因通常是各種管家基因，例如ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。它們的表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，并且可以在生物體幾乎全部組織及各個(gè)生長(zhǎng)階段持續(xù)表達(dá)。在不同的組織中，管家基因mRNA的含量都很豐富。

內(nèi)參基因的作用

在基因表達(dá)差異分析中內(nèi)參基因可以用于校正上樣量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下不會(huì)發(fā)生表達(dá)改變的基因作內(nèi)參。
 

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：

1.不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴(kuò)增；

2.高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá)；

3.穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其表達(dá)量是近似的，無(wú)顯著性差別；

4.表達(dá)水平與細(xì)胞周期及是否活化無(wú)關(guān)；

5.其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；

6.不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。
 

內(nèi)參基因的評(píng)估

然而，已有證據(jù)表明，一些用于控制實(shí)驗(yàn)偏差的傳統(tǒng)內(nèi)參基因僅在特定條件下是相對(duì)恒定的表達(dá)水平。很明顯，內(nèi)參基因是具有一定的特異性，沒(méi)有通用的內(nèi)參基因可用于所有實(shí)驗(yàn)的內(nèi)控，這也表明在進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)之前，必須正確選擇內(nèi)參基因。那么在選擇內(nèi)參基因時(shí)，可以通過(guò)geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來(lái)評(píng)估，這是保證結(jié)果可靠準(zhǔn)確的前提。其次可對(duì)候選的內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的篩選。首選在不同樣本中均穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，選擇SD最小的基因作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。

現(xiàn)在對(duì)內(nèi)參基因的選擇有所了解了嗎？

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