上一次锘海光片技術(shù)小課堂簡單介紹了樣本的放置，這次將會(huì)繼續(xù)往下介紹數(shù)據(jù)的獲取。

 

4.數(shù)據(jù)的獲取

由于每種顯微鏡各自不同的特點(diǎn)，用戶的使用體驗(yàn)也是不同的。光片顯微鏡的使用體驗(yàn)可能感覺與傳統(tǒng)顯微鏡特別不同，因?yàn)榇蠖鄶?shù)設(shè)置都是完全數(shù)字化的，沒有目鏡，所以無法通過眼睛快速檢查樣品的位置和方向。此外，位移臺(tái)的控制可能與傳統(tǒng)顯微鏡的界面也有很大不同�？焖賿呙铇悠氛麄�(gè)深度的能力，無需像共聚焦顯微鏡那樣等待掃描完成，使得光片顯微鏡的工作流程快速且直接。同樣，快速的數(shù)據(jù)獲取速度使得實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚩焖龠B續(xù)地進(jìn)行。然而，快速的數(shù)據(jù)獲取會(huì)導(dǎo)致大量數(shù)據(jù)迅速積累，用戶需在謹(jǐn)慎考慮數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與數(shù)據(jù)處理能力的情況下方可進(jìn)行長時(shí)間拍攝。

 

4.1確定樣本方向

在普通的寬場(chǎng)熒光顯微鏡中，安裝好的樣品被放置在顯微鏡臺(tái)上，然后從上面或下面（垂直或倒置）進(jìn)行照明和檢測(cè)。光片顯微鏡由于可以擁有不同的照明路徑，給樣品的放置增加了另一個(gè)自由度，從而允許用戶準(zhǔn)確定位樣品。此外，多組數(shù)據(jù)可以從不同的路徑獲得，并拼合在一起，也能使顯微鏡的穿透深度固定的情況下獲得更大的成像范圍。同時(shí)，在光片顯微鏡中，樣品的放置方向也比經(jīng)典的單透鏡顯微鏡更為重要。用戶需要使樣品相對(duì)于照明軸和檢測(cè)軸方向正確：光片需要在不通過樣品的高折射或高吸收結(jié)構(gòu)的情況下到達(dá)感興趣的區(qū)域。

 

4.2光片校準(zhǔn)

與傳統(tǒng)熒光顯微技術(shù)不同的是，圖像采集過程中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是光片的校準(zhǔn)。在光片顯微鏡中，我們需要辨別調(diào)整光片的基本參數(shù)，即高度和厚度，以及正確地將光片定位在檢測(cè)透鏡的焦平面上。這三個(gè)步驟對(duì)于獲得光片好的層析能力以及可靠性、一致性高的結(jié)果都是必不可少的。此外，光片的校準(zhǔn)和對(duì)其參數(shù)的了解可能是決定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)策略的關(guān)鍵性先決條件，例如調(diào)整軸向的步進(jìn)和之后的分析步驟。

 

① 調(diào)整光片的寬度

光片需要覆蓋視野的整個(gè)寬度，在使用掃描光片的情況下，可以通過設(shè)置掃描振幅較容易地調(diào)整此屬性。如果是靜態(tài)光片，則必須擴(kuò)大照明光束。入射光束的強(qiáng)度分布通常遵循高斯模式，只有光束的中心部分被認(rèn)為是均勻的。對(duì)于光片寬度的限制通常使用狹縫光闌，以避免視野之外不必要的激光輸入。

② 調(diào)整光片的厚度

如之前所說，光片的厚度定義了軸向光學(xué)截面的范圍。光片越薄，沿光束傳播軸的束腰范圍越小，因此可用視野越�。▓D2-1A和B）。這些光片特性通常由光學(xué)元件決定，通常在儀器的設(shè)計(jì)過程中進(jìn)行選擇。用戶只需在實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)光片的的正確校準(zhǔn)即可（圖4-1A）。

③確認(rèn)光片位置

一旦決定了來為所需視野提供光片的照明物鏡，則需要對(duì)光片進(jìn)行校準(zhǔn)。第一步是沿著光片射入的方向平移光片，直到它在視野中居中（圖4-1B）；第二步是要使光片在檢測(cè)路徑的焦平面上（圖4-1C）；第三步需要確認(rèn)光片在整個(gè)視野內(nèi)與焦平面重疊（圖4-1D）。

 

 

圖 2-1 光片的特性與生成（A）薄薄的光片只能在小范圍內(nèi)產(chǎn)生均勻的光照；（B）相比之下，只有較厚的光片才能獲得較大的視野；（C）光片可以由圓柱形透鏡一維聚焦激光束（靜態(tài)光片）或通過快速掃描激光束穿過視場(chǎng)（掃描光片）生成。

 

 

圖4-1 光片校準(zhǔn)（A）（從上方）校準(zhǔn)良好的光片；（B）光片束腰位置需要在視野中央；（C）光片需要精確地放置在檢測(cè)物鏡的焦平面上；（D）照明軸需要與檢測(cè)軸正交。

 

 

 4.3選擇正確的成像參數(shù) 

光片顯微鏡具有速度快、光毒性低的特點(diǎn)，可以在不影響樣品的情況下對(duì)多個(gè)平面或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行成像。雖然人們可能會(huì)追求更高的空間和時(shí)間分辨率，但產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是巨大的；因此，需要有數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和強(qiáng)大的計(jì)算能力來處理和歸檔數(shù)據(jù)。與其他顯微鏡技術(shù)相比，在使用光片顯微鏡時(shí)，用戶需要在實(shí)驗(yàn)前考慮必要的信息量。

 

 

需要考慮的采集參數(shù)有：

• 光片厚度

• 軸向步進(jìn)

• 相機(jī)的曝光時(shí)間和區(qū)域

• 激光照明功率

• 拍攝幀速

• 多視圖采集

 

用戶需要在圖像質(zhì)量和數(shù)據(jù)大小之間找到適當(dāng)?shù)钠胶�。較薄的光片提供了好的軸向分辨率，但需要拍攝更多數(shù)量的圖片。較短的曝光時(shí)間和光照時(shí)間可以減少移動(dòng)樣本時(shí)的運(yùn)動(dòng)模糊，提高時(shí)間分辨率，但在相同的信噪比下，每幀需要更高的激發(fā)能量，意味著需要使用更高的激光功率。同時(shí)，提高幀速會(huì)在提高時(shí)間分辨率的同時(shí)也會(huì)增加數(shù)據(jù)量。光片顯微鏡的一個(gè)特點(diǎn)是能夠從不同方向拍攝樣本，當(dāng)拍攝的樣品太大而無法從一個(gè)方向完成成像時(shí)會(huì)非常有用。多視圖采集后的三維重構(gòu)還能在一定程度上彌補(bǔ)單向成像中由于光片在樣品內(nèi)受到影響導(dǎo)致的瑕疵和失真，從而達(dá)到提升分辨率的效果。

 

 

參考文獻(xiàn)：

1.Huisken,J., & Stainier, D. Y. R. (2007). Even fluorescence excitation bymultidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). OpticsLetters, 32(17), 2608–2610.

2.Preibisch,S., Saalfeld, S., Schindelin, J., & Tomancak, P. (2010). Software forbead-based registration of selective plane illumination microscopy data. NatureMethods, 7(6), 418–419. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth0610-418.