細(xì)胞復(fù)蘇流程與操作注意事項(xiàng)
每次復(fù)蘇細(xì)胞都手忙腳亂？好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了？
今天教你如何有條不紊地高效復(fù)蘇細(xì)胞！
細(xì)胞復(fù)蘇流程
1、從液氮罐中取出凍存細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中融化，輕柔離心后收集細(xì)胞沉淀；
2、緩慢用移液槍吸去上清，加入適量濃度和體積的完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶；
3、根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶的體積，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。
操作中的注意事項(xiàng)
（一）、小心取出凍存管
許多小型液氮罐的設(shè)計(jì)是將細(xì)胞凍存在帶蓋的提籃中，提籃會(huì)浸沒(méi)在液氮中。由于提籃中沒(méi)有孔格的劃分，細(xì)胞凍存管無(wú)法擺放整齊。取用細(xì)胞時(shí)候，實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)常需要逐一查看，尋找計(jì)劃復(fù)蘇的細(xì)胞。此過(guò)程耗時(shí)過(guò)久，可能會(huì)導(dǎo)致其他凍存管內(nèi)的細(xì)胞受損。
一般大型液氮罐會(huì)配置成列的凍存架和細(xì)胞存儲(chǔ)盒，取出凍存架和放回都需要平穩(wěn)小心處理，避免帶出大量液氮。罐內(nèi)液氮較多時(shí)，可適當(dāng)在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。
注意
（二）、快速融化待復(fù)蘇細(xì)胞
當(dāng)找到準(zhǔn)備復(fù)蘇的凍存管后，不要著急放入水浴鍋，先檢查封口膜是否完整，如果貼了醫(yī)用膠布，膠布是否有破損？因?yàn)橐坏?strong>凍存管中有液氮流入，直接放入水浴鍋中，管內(nèi)壓力驟升，可能導(dǎo)致凍存管炸裂，危及實(shí)驗(yàn)人員。
復(fù)蘇細(xì)胞的核心技術(shù)，簡(jiǎn)而言之就是快融。從液氮罐中取出的細(xì)胞，需及時(shí)放入37℃水浴鍋，進(jìn)行快速融化，期間需不停地輕柔搖晃凍存管。最好在兩分鐘內(nèi)完全融化細(xì)胞。出于衛(wèi)生考慮，有些細(xì)胞房沒(méi)有水浴鍋，所以很多復(fù)蘇操作，需要在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。如果兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室距離較遠(yuǎn)，且實(shí)驗(yàn)室室溫較高，可提前準(zhǔn)備一只干凈的燒杯，裝入37℃的水作中間緩沖。
注意
（三）、輕柔收集已復(fù)蘇細(xì)胞
收集細(xì)胞前，要將所用培養(yǎng)基提前配制預(yù)熱并擺放整齊，避免現(xiàn)用現(xiàn)配耽誤復(fù)蘇進(jìn)程，讓剛復(fù)蘇的細(xì)胞及時(shí)接觸正常的生長(zhǎng)環(huán)境。若凍存液中存在DMSO，請(qǐng)根據(jù)所用細(xì)胞對(duì)其敏感的程度，判斷要不要離心棄除。
剛復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)比較脆弱，應(yīng)避免多次吹打和離心。比如原代細(xì)胞在復(fù)蘇融化后，盡量不要進(jìn)行離心操作，直接補(bǔ)足培養(yǎng)基，使細(xì)胞分散均勻，等3-6小時(shí)，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行換液處理。此方式也適用于其他凍存狀態(tài)一般的細(xì)胞。
（四）、培養(yǎng)前，計(jì)數(shù)&活力檢測(cè)
復(fù)蘇過(guò)程中，細(xì)胞計(jì)數(shù)必不可少。原則上，凍存前和復(fù)蘇后，都需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活率分析，判別凍存的效果和細(xì)胞復(fù)蘇后的狀態(tài)。
2018年9月，美國(guó)藥典（USP-NF）出臺(tái)了關(guān)于細(xì)胞凍存相關(guān)政策并明確指出，臺(tái)盼藍(lán)不能很好地識(shí)別剛復(fù)蘇的細(xì)胞（細(xì)胞的種類和臺(tái)盼藍(lán)的濃度不同，對(duì)染色結(jié)果都有較大的影響），建議使用兩種以上的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，如結(jié)合熒光染色計(jì)數(shù)法。
瑞沃德C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 
內(nèi)置雙通道熒光柱（紅綠，紅藍(lán)，綠藍(lán)），可疊加兩種熒光結(jié)果，完成復(fù)雜的細(xì)胞樣品分析，AO/PI染色，一鍵計(jì)數(shù)便知結(jié)果。讓操作更簡(jiǎn)易，計(jì)數(shù)更精準(zhǔn)圖片
今天教你如何有條不紊地高效復(fù)蘇細(xì)胞！
細(xì)胞復(fù)蘇流程
1、從液氮罐中取出凍存細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中融化，輕柔離心后收集細(xì)胞沉淀；
2、緩慢用移液槍吸去上清，加入適量濃度和體積的完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶；
3、根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶的體積，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。
操作中的注意事項(xiàng)
（一）、小心取出凍存管
許多小型液氮罐的設(shè)計(jì)是將細(xì)胞凍存在帶蓋的提籃中，提籃會(huì)浸沒(méi)在液氮中。由于提籃中沒(méi)有孔格的劃分，細(xì)胞凍存管無(wú)法擺放整齊。取用細(xì)胞時(shí)候，實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)常需要逐一查看，尋找計(jì)劃復(fù)蘇的細(xì)胞。此過(guò)程耗時(shí)過(guò)久，可能會(huì)導(dǎo)致其他凍存管內(nèi)的細(xì)胞受損。
一般大型液氮罐會(huì)配置成列的凍存架和細(xì)胞存儲(chǔ)盒，取出凍存架和放回都需要平穩(wěn)小心處理，避免帶出大量液氮。罐內(nèi)液氮較多時(shí)，可適當(dāng)在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。
注意
- 液氮在室溫下會(huì)快速氣化吸熱，濺到皮膚或者眼睛上會(huì)燙傷。從液氮罐中取細(xì)胞時(shí)，需要做好防護(hù)工作——戴好厚手套和護(hù)目鏡。
- 不要將凍存管丟入液氮罐，以防液氮濺出。
（二）、快速融化待復(fù)蘇細(xì)胞
當(dāng)找到準(zhǔn)備復(fù)蘇的凍存管后，不要著急放入水浴鍋，先檢查封口膜是否完整，如果貼了醫(yī)用膠布，膠布是否有破損？因?yàn)橐坏?strong>凍存管中有液氮流入，直接放入水浴鍋中，管內(nèi)壓力驟升，可能導(dǎo)致凍存管炸裂，危及實(shí)驗(yàn)人員。
復(fù)蘇細(xì)胞的核心技術(shù)，簡(jiǎn)而言之就是快融。從液氮罐中取出的細(xì)胞，需及時(shí)放入37℃水浴鍋，進(jìn)行快速融化，期間需不停地輕柔搖晃凍存管。最好在兩分鐘內(nèi)完全融化細(xì)胞。出于衛(wèi)生考慮，有些細(xì)胞房沒(méi)有水浴鍋，所以很多復(fù)蘇操作，需要在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。如果兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室距離較遠(yuǎn)，且實(shí)驗(yàn)室室溫較高，可提前準(zhǔn)備一只干凈的燒杯，裝入37℃的水作中間緩沖。
注意
- 融化中不要讓水浴鍋中的水，流入凍存管中造成污染。
- 復(fù)蘇過(guò)程中要格外注重?zé)o菌操作，經(jīng)水浴鍋融化后，需對(duì)凍存管消毒。最好同時(shí)更換手套和口罩，全程避免移液器接觸管口及管壁。可以將凍存管放入無(wú)菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
（三）、輕柔收集已復(fù)蘇細(xì)胞
收集細(xì)胞前，要將所用培養(yǎng)基提前配制預(yù)熱并擺放整齊，避免現(xiàn)用現(xiàn)配耽誤復(fù)蘇進(jìn)程，讓剛復(fù)蘇的細(xì)胞及時(shí)接觸正常的生長(zhǎng)環(huán)境。若凍存液中存在DMSO，請(qǐng)根據(jù)所用細(xì)胞對(duì)其敏感的程度，判斷要不要離心棄除。
剛復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)比較脆弱，應(yīng)避免多次吹打和離心。比如原代細(xì)胞在復(fù)蘇融化后，盡量不要進(jìn)行離心操作，直接補(bǔ)足培養(yǎng)基，使細(xì)胞分散均勻，等3-6小時(shí)，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行換液處理。此方式也適用于其他凍存狀態(tài)一般的細(xì)胞。
（四）、培養(yǎng)前，計(jì)數(shù)&活力檢測(cè)
復(fù)蘇過(guò)程中，細(xì)胞計(jì)數(shù)必不可少。原則上，凍存前和復(fù)蘇后，都需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活率分析，判別凍存的效果和細(xì)胞復(fù)蘇后的狀態(tài)。
2018年9月，美國(guó)藥典（USP-NF）出臺(tái)了關(guān)于細(xì)胞凍存相關(guān)政策并明確指出，臺(tái)盼藍(lán)不能很好地識(shí)別剛復(fù)蘇的細(xì)胞（細(xì)胞的種類和臺(tái)盼藍(lán)的濃度不同，對(duì)染色結(jié)果都有較大的影響），建議使用兩種以上的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，如結(jié)合熒光染色計(jì)數(shù)法。
瑞沃德C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
標(biāo)簽：
細(xì)胞復(fù)蘇
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
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