簡介
 
毫無疑問，在可見的未來，數(shù)字化病理學(xué)是病理學(xué)的希望。如今許多病理實(shí)驗(yàn)室開始采用這一技術(shù)，應(yīng)用到包括遠(yuǎn)程病理學(xué)（遠(yuǎn)程會(huì)診）、定量圖像分析和實(shí)驗(yàn)室工作流程的數(shù)字化。數(shù)字切片掃描系統(tǒng)是數(shù)字化病理的一個(gè)重要組成部分，它使以玻璃病理切片為基礎(chǔ)的工作流程轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字工作流程。隨著越來越多的病理實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字病理，經(jīng)常問的一個(gè)關(guān)鍵問題是“為什么圖像大小與我的顯微鏡不一樣？例如當(dāng)用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的20x物鏡觀察玻璃切片，然后用相同20x物鏡掃描的數(shù)字圖像來觀看時(shí)，所感知到的圖像大小可能不相同。
 
許多病理醫(yī)生第一次用數(shù)字切片時(shí)驚訝地發(fā)現(xiàn)，用同一個(gè)物鏡獲得的圖像，常規(guī)光學(xué)顯微鏡上的與數(shù)字顯示器相比，比例相差如此之大，這是所有數(shù)字病理成像系統(tǒng)中常見的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情況的原因是，全切片圖像（WSI）的大小取決于（1）掃描儀使用的物鏡放大倍數(shù)，（2）數(shù)碼相機(jī)傳感器內(nèi)單個(gè)像素的大小和數(shù)量，（3）顯示器單個(gè)像素的大小和數(shù)量。圖1所示的圖像說明了這一點(diǎn)。
 
圖1：使用相似的×20物鏡顯示闌尾中的蟯蟲圖像，但傳感器像素大小不同。
 
圖1顯示了在兩個(gè)不同的WSI掃描系統(tǒng)的圖像。兩臺(tái)掃描儀都使用一個(gè)×20物鏡來獲取數(shù)字圖像。a的圖像來自掃描儀廠商1，由5.5微米像素傳感器拍攝，b的圖像來自掃描儀廠商2，使用10微米像素大小的傳感器拍攝。顯示在屏幕上，a比b圖像大1.7倍，來自廠商1的掃描儀圖像由于其像素分辨率高而包含更多信息。當(dāng)以全數(shù)字分辨率觀看時(shí)，保持物鏡恒定并改變傳感器中的像素大小將產(chǎn)生不同感知尺寸的圖像。依WSI系統(tǒng)中的數(shù)碼相機(jī)和物鏡的數(shù)值孔徑（NA）的不同，圖像的數(shù)字分辨率可能會(huì)有很大的不同。
 
放大率不是分辨率，光學(xué)分辨率不是數(shù)字分辨率
 
另一個(gè)重要的考慮因素是放大率和分辨率之間的區(qū)別。在理解這一點(diǎn)之前，我們必須了解數(shù)字分辨率和光學(xué)分辨率之間的區(qū)別。本質(zhì)上，所有的分辨率定義都是描述兩個(gè)物體在圖像中可以被區(qū)分的最小距離。例如，使用一個(gè)觀察系統(tǒng)，如果兩個(gè)物體在“模糊”在一起并顯示為一個(gè)物體之前，兩個(gè)物體之間的最小距離為1微米，則分辨率為1微米，即系統(tǒng)可以分辨相距1微米的兩個(gè)物體。對于沒有傳感器的純光學(xué)系統(tǒng)，分辨率取決于光和玻璃光學(xué)系統(tǒng)的相互作用，這在顯微鏡中通常被描述為瑞利（Rayleigh）分辨率極限（R）。其計(jì)算：
R=0.61λ / NA
如果我們知道光的顏色（綠光的λ約為0.53微米）和玻璃光學(xué)元件的性質(zhì)(數(shù)值孔徑即NA), 數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力,是物鏡的重要性質(zhì)之一。理論上NA=nsinθ，因此增大物鏡的數(shù)值孔徑（NA）有兩個(gè)途徑：
:⑴ 增大透鏡的直徑或減小物鏡的焦距即設(shè)計(jì)短焦距的物鏡,以增大孔徑半角θ。但此法會(huì)導(dǎo)
致像差增加及制造困難,一般不采用。實(shí)際上sinθ的最大值只能達(dá)到0.95。
⑵ 增大物鏡與觀察物之間的折射率n。干系物鏡是以空氣為介質(zhì)的,折射率n=1,一般用于低倍物鏡。油系物鏡常以松柏油(n=1.515,NA=1.4)，圖2顯示這樣關(guān)系：
   
圖2：不同數(shù)值孔徑的物鏡具備不同的分辨率
 
因此，我們看到基于光學(xué)，光圈大小和光的波長都很重要，但這種放大并不直接轉(zhuǎn)化為解析力或分辨率。因?yàn)槲覀冃枰�更高的分辨率時(shí)，會(huì)使用更高NA值的物鏡，而通常該物鏡也具有更高的放大倍數(shù)，改變NA和放大倍數(shù)經(jīng)常同時(shí)發(fā)生，所以放大倍數(shù)與分辨率或解析力往往讓人混淆和困惑。例如，從0.5NA物鏡的×20轉(zhuǎn)換為0.9NA的×40物鏡時(shí)，最小分辨率從0.64微米提升到0.36微米（對于綠光）。對于0.9NA物鏡，與0.5NA物鏡相比，得到了更高的分辨率，真正的分辨率提高來自于NA的增加，而不是放大倍數(shù)的增加。
 
當(dāng)涉及到數(shù)碼相機(jī)傳感器和顯示器器時(shí)，分辨率不再僅僅由光學(xué)鏡頭決定。這是因?yàn)橄袼氐拇笮『拖袼氐臄?shù)量也決定了兩個(gè)物體是否會(huì)作為單獨(dú)或分開的物體顯示出來。使用上述例子，如果兩個(gè)物體在投射到傳感器上時(shí)相距1微米（被物鏡“放大”后），像素大小為10微米，則這兩個(gè)物體很可能看起來是一個(gè)。這意味著傳感器無法解析1微米大小的圖像特征[圖。在本例中，傳感器需要0.5微米的像素大小，以確保兩個(gè)物體顯示為兩個(gè)不同的物體， 而不是融合在一起不能分辨。根據(jù)Nyquist公式，像素大�。≒）有以下公式表達(dá)：
P=R /2=0.3λ/NA
光學(xué)分辨率僅取決于物鏡和光的顏色，而數(shù)字分辨率則取決于物鏡、數(shù)碼相機(jī)傳感器和顯示器，并且在整體系統(tǒng)性能方面三者密切交織在一起。物鏡必須具有“看到”感興趣特征所需的光學(xué)分辨率；數(shù)字分辨率無法彌補(bǔ)物鏡的不足。然而，如果傳感器的數(shù)字分辨率不夠好，傳感器可能會(huì)使玻璃物鏡的優(yōu)勢喪失。
 
放大的作用
 
放大是指物體表面尺寸的變化，使物體更容易被看見。在用于病理學(xué)的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡中，使用一系列放大倍數(shù)的物鏡，以確保通過肉眼觀察到的圖像足夠大，便于觀察。在這種情況下，放大不一定用來提高分辨率，而是用來使觀看更容易。在WSI系統(tǒng)中，隨著數(shù)碼相機(jī)傳感器和顯示器的引入，放大倍數(shù)起到了匹配數(shù)碼分辨率和光學(xué)分辨率的作用。在前面的例子中，我們不能用10微米分辨率的傳感器看到1微米大小的物體，除非我們將圖像放大20倍。一旦傳感器以良好的保真度將圖像數(shù)字化，就不再需要額外的放大，圖像是否大小合適且易于查看現(xiàn)在取決于顯示器了。數(shù)字顯示器上的圖像可能與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡圖像有很大不同，不再是病理醫(yī)生平時(shí)熟悉的常規(guī)光學(xué)顯微鏡視野圖像，病理醫(yī)生需要盡快熟悉新的數(shù)字環(huán)境。
 
圖3：顯示工作站顯示器器增加的放大倍數(shù)的圖形
 
傳統(tǒng)的顯微鏡提供了一對10x的目鏡供觀察，從而在觀察切片時(shí)提供了額外的放大倍數(shù)。類似地，在顯示器上顯示數(shù)字圖像可以額外放大倍數(shù)[圖-即數(shù)字放大。前面10微米像素的例子中，當(dāng)這個(gè)像素值移動(dòng)到一個(gè)典型的工作站顯示器上時(shí)，它通常會(huì)顯示為270微米的像素，意味著數(shù)字放大倍數(shù)為27x，比以前用肉眼鏡檢所達(dá)到的放大倍數(shù)還要高。如果我們用一個(gè)更常用的傳感器（例如像素尺寸6.45微米）），放大系數(shù)變?yōu)閪42x，因此，如果不考慮物鏡的放大倍數(shù)，很明顯，圖像的大小比例肯定會(huì)有所不同，取決于所使用的傳感器。計(jì)算機(jī)屏幕上圖像的放大率還受觀看圖像的人離顯示器屏幕遠(yuǎn)近，你坐得越遠(yuǎn)，圖像看起來越小。
 

表1：顯示器分辨率和相機(jī)傳感器對放大率的影響。每像素的微米是掃描儀分辨率的最佳指標(biāo)。計(jì)算中使用了96 dpi的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)視器分辨率
	物鏡倍率	感光相機(jī)	60cm外放大倍率	大小(微米)	微米/像素
廠商1	1.25	5.5	3	8.800	4.400
	20	5.5	40	0.550	0.275
	40	5.5	80	0.275	0.138
廠商2	1.25	6.5	2	10.400	5.200
	20	6.5	34	0.650	0.325
	40	6.5	68	0.325	0.163
廠商3	1.25	7.4	2	11.840	5.920
	20	7.4	30	0.740	0.370
	40	7.4	60	0.370	0.185
泰立瑞	1.25	10	1	16.000	8.000
	20	10	22	1.000	0.500
	40	10	44	0.500	0.25

 
總結(jié)
 
數(shù)字病理成像系統(tǒng)的圖像放大是一個(gè)復(fù)雜問題。數(shù)字病理圖像查看與傳統(tǒng)顯微鏡檢查之間存在差異，是必然的，可能導(dǎo)致供應(yīng)商和病理醫(yī)生之間的相互不了解。最重要的是WSI不同于傳統(tǒng)的顯微鏡，它有額外的傳感器和顯示器。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡圖像質(zhì)量名稱可能不再適用于數(shù)字WSI；與其使用“40x”，更可取和科學(xué)的做法是使用可在不同系統(tǒng)之間進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)來表示圖像質(zhì)量，微米/像素將可能被更廣泛和更恰當(dāng)?shù)赜糜诒硎緮?shù)字圖像中的特征。微米/像素是比“放大率”更好的、獨(dú)立于各個(gè)生產(chǎn)商的指標(biāo)，應(yīng)被視為未來數(shù)字病理系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)。市場上各種數(shù)字病理系統(tǒng)之間的分辨率可能不同，微米/像素的顯示可以幫助計(jì)算機(jī)輔助診斷（CAD）結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)樗�顯示分辨率。提供較低微米/像素值的WSI掃描儀讓病理醫(yī)生從圖像中獲取更多信息，病理醫(yī)生可能提供更快的診斷，因?yàn)楦�少的讀片時(shí)間，節(jié)省大量的時(shí)間。