起初認為IgG4不結(jié)合FcR，不引起ADCC，CDC效應(yīng)。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然結(jié)合力低于IgG1，但是IgG4依然可以結(jié)合FcγRI，F(xiàn)cγRIIB, FcγRIIC,  FcγRIIIA。

 

IgG亞型和FcγR親和力（文獻1）

 

TGN1412 (anti-CD28superagonist IgG4) Phase 1臨床，因為交聯(lián)FcγRIIB，遇到細胞因子風暴。

 

IgG1和IgG4的藥物上的差異，是重鏈γ1和γ4。這些差異主要集中在鉸鏈區(qū)和CH2，在生產(chǎn)過程中也會影響下游工藝。在低pH條件下，IgG4的穩(wěn)定性不如IgG1。

 

γ4第228位絲氨酸是IgG4s穩(wěn)定的關(guān)鍵氨基酸，且沒有專利保護，被大量使用。

 

15種已批準IgG4抗體中，12種在其恒定重鏈中被修改，而在50種已批準的IgG1基療法中只有14種含有恒定的重鏈修飾。此外，目前處于PhaseIII的大多數(shù)IgG4抗體都具有恒定的重鏈修飾。

下表為IgG4抗體及其Fc段修飾情況

 

IgG4抗體重鏈改造

 

1. 降低Fc效應(yīng)功能的突變

 

1989年哥倫比亞大學提出了第一個專利申請(WO8907142)。其想法是交換不同IgG亞類的結(jié)構(gòu)域，以獲得具有所需特性的抗體。盡管在1996年獲得了一項歐洲專利，但Celltech提出了反對意見，該專利最終在2006年被撤銷。

 

1993年Arch Development提出另一份申請(WO9428027)，聲稱其IgG4(以L235E突變)處于沉默狀態(tài)。這份申請是突變的抗CD3抗體，而不是任何有這種突變的抗體。

 

1994年Celltech提出了一項申請(WO9526403)，對減少補體激活提出了廣泛申請，但沒有獲得專利。

 

2000年，Genentech提交了一份申請(WO200042072)，其中包含了數(shù)百個單一的變體，后來獲得了數(shù)十項專利。這些專利與FcγR結(jié)合增強有關(guān)，但它們也包含減少與所有FcγR結(jié)合的突變的例子（例如D265A，US 7332581），這些專利將于2020年到期。

 

2003年，Xencor在WO2004029207中提出了幾項申請，其中包括數(shù)百個調(diào)節(jié)與FCγR親和力的Fc變異體，獲得了美國專利，例如L328替代減少ADCC，或A330R突變減少與FCγRIIIA的結(jié)合。有人反對，包括涵蓋F243L突變的EP2364996B1專利。

 

Alexion開發(fā)了一種廢除效應(yīng)功能的技術(shù)，將IgG2(T260)與IgG4 Fc末端連接，產(chǎn)生了一個與C1q和FcγR結(jié)合非常弱的分子。C5抗體（依庫珠單抗eculizumab(Soliris)和依庫麗單抗raulizumab(ULTOMIRIS)）使用了此技術(shù)。

 

 

Centocor 申請了WO2011066501。Janssen(前Centocor)最終從WO2011066501專利家族獲得了一個變異IgG4(S228P、F234A、L235A、G237A和P238S)的專利(US 10053513B2)。

 

2011年，默克申請WO2011149999描述了由F243A/V264A突變組合組成的唾液化Fc多肽。這些突變導(dǎo)致Fcγ受體與IgG4結(jié)合減少。

 

IgG4突變L234A和L235A，通過阻斷Fc/Fcγ受體界面內(nèi)的一個夾心脯氨酸基序，進一步降低效應(yīng)功能。葛蘭素史克2016年申請專利WO2017079369，描述了新的IgG2 Fc和IgG4 Fc突變組合，特別是IgG4的E233P/F234A/L235A/G236del/G237A突變組合。

 

 

IgG4及鉸鏈區(qū)

 

2. 延長半衰期的突變

 

半衰期對于任何用于治療的IgG亞類都是至關(guān)重要的，可以幫助減少劑量或給藥間隔。

 

Genentech是第一批申請專利者，其基因突變可以增強人抗體與FcRn的結(jié)合。他們從WO200042072專利家族獲得了三項專利，涉及307、380和434位點。434位突變的專利只涵蓋IgG1，在2020年到期。

 

另一個先驅(qū)，Medimmune(現(xiàn)屬阿斯利康)，2001年從WO02060919申請家族獲得了一項美國專利(US 7083784)，并提出了廣泛權(quán)益，涉及252/254/256/309/311/433/434/436位點的修改。該專利涵蓋了著名的M252Y/S254T/T256E(YTE)突變組合，該突變組合可使猴的血清抗體半衰期增加近4倍，并使motavizumab在人類體內(nèi)的半衰期延長至100天。該家族還授予了其他七項專利，將保護范圍擴大到位于或接近Fc/FcRn接口的其他突變組合(308/311/385/386/389/428)。歐洲專利則不同，因為EP1355919B1專利主要保護單一252位點(Y、F、W、T突變)，EP2354149B1專利主要保護433K/434F/436H組合，2022年到期。

 

從WO2004035752專利家族中，Abbott被授予美國和歐洲兩項專利，其中包括T250Q/E和M428L/F替換抗體。不同亞類和不同CDR的抗體，包括突變組合T250Q/M428L(QL)，在恒河獼猴中表現(xiàn)出近2倍的IgG半衰期增強。

 

Xencor擁有多個廣泛專利，包括美國和歐洲的專利：1)N434S、308 W、308 Y和308 F突變(WO2006053301家族，2026年到期)；2)M252Y/M428L和D259I/V308F組合(WO2009058492)；3)著名的M428L/N434S(LS)突變組合(WO2009086320)，據(jù)報在人類中有4倍的延長半衰期(將于2028年到期)。Xencor的專利組合還包括T307Q/N434S、M428L/V308F和Q311V/N434S組合專利。

 

2009年，LFB獲得美國專利(WO2010106180)，涉及12個突變組合，增強FcRn結(jié)合。

 

2009年，Genentech提出了一項專利申請(WO2010045193)，以保護先前的申請中已經(jīng)描述的位置的突變組合，特別是由T307Q/N434A突變組成的組合，它導(dǎo)致了25天半衰期。盡管被質(zhì)申請疑新穎性，但美國和歐洲的申請尚未放棄。

 

其他申請，例如2013年的BioAtla(WO2013163630)。發(fā)布了幾個不同突變，(US 20180186863)申請中的E258F/V427T突變組合。然而，在其他申請中并沒有描述它們的突變體；示例部分只指出，與野生型Fc和中性pH下的正常結(jié)合相比，在酸性pH條件下，被測變異體的FcRn結(jié)合量為2~80倍。挪威奧斯陸大學(WO2017158426)、Kookmin大學(KR101792191多個申請)和MacroGenics(US20190010243)也發(fā)現(xiàn)了性能增強的新突變。

 

通過用帶正電荷的氨基酸代替帶負電荷的氨基酸，降低等電點，降低血清半衰期。例如，中外制藥獲得了一項廣泛的歐洲專利(EP 2006381)，該專利涉及通過改變等電點的可變區(qū)域的任何修改來調(diào)節(jié)血清半衰期。Alexion和其他人一起反對這項專利，中外制藥的專利最終被撤銷，但中外制藥對這一決定提出了上訴。

 

從WO2016227母體申請中，Xencor還擁有一項歐盟(EP3029066)和兩項美國專利(US 8697641和US9605061)，涉及恒定區(qū)域的等電點修改，但它們僅限于特定的突變組合。

IgG結(jié)合FcRn（Am J Transplant. 2019 July ; 19(7): 1881–1887）

 

3. 與穩(wěn)定和下游工藝相關(guān)的突變

 

S228P突變解決了IgG4穩(wěn)定性問題。

 

Celltech的研究人員在1992發(fā)表的文獻表明，在IgG4以外的所有IgG亞類中都有一個S228P替換(脯氨酸存在于此位置)，足以消除人IgG4抗體的異質(zhì)性。1994年，Celltech公司提出了一項針對E-選擇素抗體的專利申請(WO9526403)，其中包括降低效應(yīng)功能的L235E替代和廢除半抗體分子形成的S228P替代。然而，這種眾所周知的突變從未得到過專利保護。

 

這一發(fā)現(xiàn)對IgG4衍生抗體的發(fā)展產(chǎn)生了重大影響。這種突變幾乎包含在大多新開發(fā)的IgG4抗體中。

 

2006年，IgG4穩(wěn)定專利轉(zhuǎn)移到CH3，通過突變R409來解決IgG4在低pH條件下聚集的問題(WO2006033386)。在示例部分，他們表明S228P/L235E/R409K變異體在低pH條件下比S228P/L235E變異體表現(xiàn)出較少的聚集傾向。美國和歐洲的專利都被授予了關(guān)于抑制IgG4聚集的突變組合的廣泛權(quán)益。

 

Genmab申請(WO2008145142)，描述了一個相同的突變減少了Fab-Arm的交換，但是他們歐洲專利遭到反對，主要是因為之前協(xié)和麒麟的專利。

 

Genmab對其他改善穩(wěn)定性突變的申請(WO2010063785)，例如K370Q/E(以及其他)，都獲得了美國和歐洲的專利。2016年，他們還提交了一份申請(US2017029521)，要求在370位置進行任何突變，但僅限于由CXPC或CPXC(非S228P)序列組成的多肽鉸鏈區(qū)域。

 

2010年，Biogen提出專利申請(WO2010085682)，該技術(shù)涉及IgG 1 CH3結(jié)構(gòu)域的瓊脂化、穩(wěn)定IgG4。他們的想法是構(gòu)建一種具有大量突變的沉默的IgG，以減少由�；�化引起的熱穩(wěn)定性損失。他們描述了許多突變，例如297、299、307、309、399、409和427位點突變，以及與疏水斑塊中大量疏水氨基酸相關(guān)的valine替換(在240、262、264和266中)。然而，他們撤回了申請。

 

S228P并不是唯一既能調(diào)節(jié)二硫鍵形成又能穩(wěn)定分子的突變。2010年，UCB提出了一項申請(WO2012022982)，并獲得了廣泛IgG4的歐洲專利，在131位的任何氨基酸替換為上鉸鏈中的半胱氨酸。除了S228P突變外，他們還產(chǎn)生了大量的IgG4變異體，F(xiàn)ab熱穩(wěn)定性增強，產(chǎn)品異質(zhì)性降低。然而，與唯一的S228P突變相比，尚不清楚這些新的突變是否具有真正的優(yōu)勢。

 

中外制藥獲得WO2009041613家族的歐洲專利，包括刪除G446和K447，減少IgG4C末端異質(zhì)性。根據(jù)他們的序列列表和他們的主張，這種保護適用于任何具有S228P突變的IgG4。盡管中外制藥通過刪除G446和K447氨基酸而具有降低C端異質(zhì)性的專利，但僅K447的缺失已被用于一些抗體中，如blosozumab (anti-sclerostin),dupilumab (Dupixent®, anti-IL-4Rα), emibetuzumab (anti-cMet), ixekizumab (Taltz®, anti-IL-17)。光是這種突變似乎不被任何專利所涵蓋。根據(jù)中外制藥專利WO2009041613的說法，與唯一的K447缺失相比，它的雙重缺失可以進一步降低異質(zhì)性。

 

根據(jù)Bristol-Myers Squibb在2017年提交的WO2018119380申請，S228P穩(wěn)定的IgG4會導(dǎo)致不良的生物分析和生物加工。在示例部分，他們發(fā)現(xiàn)S228PIgG4在CEX-HPLC上可能是以雙峰形式逃逸，可能是由柱內(nèi)的兩種結(jié)合構(gòu)象引起的。為了限制這種行為，在重鏈中引入了突變。主要在196位任何其他氨基酸取代賴氨酸，或在217/220/(224或225)位置替換賴氨酸。

 

參考文獻：

1. Jose M. M. Caaveiro et al，Structural analysis of Fc/FccR complexes: a blueprint for antibody design，Immunological Reviews 2015 Vol. 268: 201–221

2. Christophe Dumet，Insights into the IgG heavy chain engineering patent landscape as applied to IgG4 antibody development，MABS，2019。