在熒光定量PCR檢測實驗中可以采用多種方法來進行基因的定量。定量的方法也取決于實驗的目標。當實驗者對待測樣品中的核酸的具體拷貝數(shù)比較感興趣時，可以選擇絕對定量。如果實驗者關注的是實驗樣本與對照樣本之間的倍數(shù)變化，無需精確測定拷貝數(shù)，則選擇相對定量。目前相對定量方法適用于大多數(shù)基因表達研究，可分析對照樣本和一個或多個實驗樣本中目的基因表達水平的上調(diào)或下調(diào)。

在此我們將詳細介紹目前使用廣泛且適用于基因表達研究的相對定量方法：2^-ΔΔCq法。首先相對定量也需要仔細規(guī)劃，實驗生成的數(shù)據(jù)是相對豐度，而非確切的基因拷貝數(shù)。

相對定量方法--2^-ΔΔCq

2^-ΔΔCq法是一種非常普遍的技術，它比較了包括對照樣本 (如未處理或野生型樣本) 和內(nèi)參基因 (如看家基因表達) 在內(nèi)的實驗樣本的結(jié)果。采用該方法，可根據(jù)檢測樣本和對照樣本中內(nèi)參基因的Cq來調(diào)整相同樣本中的目的基因的Cq。最后得出的ΔΔCq值可用于測定目的基因表達量的倍數(shù)差異。具體計算方法如下：

該方法要求內(nèi)參基因和目的基因具有相一致的擴增效率，并盡可能接近100% 。確定擴增效率的方法是采用同樣的樣本進行梯度稀釋，生成內(nèi)參基因和目的基因的標準曲線（下圖）。確定內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率是否在90-110%的范圍內(nèi)，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)。

內(nèi)參基因的必要性

內(nèi)參即是內(nèi)部參照，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性。借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發(fā)生表達改變的基因作內(nèi)參。理想的內(nèi)參基因應該滿足以下條件：

① 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴增；

② 高度或中度表達，排除低表達；

③ 穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；

④ 表達水平與細胞周期及是否活化無關；

⑤ 其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似；

⑥ 不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。

內(nèi)參基因的評估，可通過geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來評估，這是保證結(jié)果可靠準確的前提。其次可對候選的內(nèi)參基因進行qPCR 實驗做進一步的篩選。首選在不同樣本中均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標準偏差，選擇SD最小的基因作為實驗內(nèi)參。

Azure Cielo^TM實時熒光定量PCR系統(tǒng)——相對定量示例

1、實驗方法

方法:從組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR Green法進行熒光定量檢測。

試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

實驗步驟:提取RNA→cDNA合成→設計特異性引物→qPCR擴增→結(jié)果分析。

2、結(jié)果計算

Step1:ΔCq值=目的基因Cq–內(nèi)參基因Cq

Step2:ΔΔCq值=處理樣品ΔCq–對照樣品ΔCq

Step3:最后計算出倍數(shù)關系: 2-ΔΔCq值

3、相對表達量結(jié)果：

Azure Cielo™實時熒光定量PCR

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