基因擴增PCR的擴增與克隆方法及一些使用的小建議
基因擴增PCR主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要專用外，還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行，擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑制備好后應有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。
基因擴增PCR的擴增與克隆方法：
�、僖锏男蛄袘挥诨蚪MDNA的高度保守區(qū)，且與非擴增區(qū)無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應的特異性
�、谝镩L度：15－40bp為宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。
③引物的堿基盡可能隨機發(fā)布，避免出現(xiàn)數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40%－75%之間。
④引物內(nèi)部應避免形成二級結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應避免有回文結(jié)構(gòu)。
�、荻䝼�引物不應有互補序列，特別是3’端應避免互補，以免形成“引物二聚體”，浪費引物。
⑥引物5’末端堿基無嚴格限制，在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)，因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應無影響。
基因擴增PCR的使用建議：
1、使用本制品時務必將Buffer反復混勻后再加，避免因組分不一導致結(jié)果差異；
2、配置和分裝反應液時請一定使用新的（無污染的）噴頭以避免污染；
3、如擴增條帶多，可適當添加酶和dNTPs；
4、當多重PCR擴增產(chǎn)物的長度均在1kb以內(nèi)時，使用3%～4％濃度的Agarosegel進行電泳分離效果。
