四川大學(xué)生物材料工程研究中心的研究團(tuán)隊(duì)在Acta Biomaterialia雜志上發(fā)表了題為“Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics”的文章，揭示了磷酸鈣陶瓷的骨誘導(dǎo)與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果不僅加深了人們對骨誘導(dǎo)機(jī)制的了解，也有助于設(shè)計(jì)新型的骨誘導(dǎo)支架。生物材料工程研究中心的肖玉梅和梁潔為共同通訊作者。

研究背景

如今，生物材料的固有骨誘導(dǎo)已經(jīng)被廣泛接受。例如，磷酸鈣（CaP）陶瓷可以在沒有外源細(xì)胞和生長因子的非骨部位誘導(dǎo)異位成骨。盡管這種骨誘導(dǎo)作用具有巨大的臨床潛力，但其內(nèi)在機(jī)制還沒有完全弄清。

骨免疫學(xué)領(lǐng)域的研究表明，免疫細(xì)胞在維持骨穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)骨重建中起著至關(guān)重要的作用。有證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)共享許多調(diào)控分子，包括細(xì)胞因子、趨化因子、受體和轉(zhuǎn)錄因子。生物材料在植入后會(huì)不可避免地引發(fā)宿主反應(yīng)，且炎癥程度會(huì)影響植入物的性能，特別是骨誘導(dǎo)性。

巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的第一道防線，在此過程中發(fā)揮重要的作用。它不僅具有吞噬作用，還可以分泌趨化因子和細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)炎癥程度。此外，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的可塑性，可根據(jù)環(huán)境變化而顯示出一系列不同功能的極化表型。M1型和M2型是目前廣泛研究的兩種表型，分別具有促進(jìn)炎癥以及減輕炎癥和促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的作用。

先前有研究表明，骨科材料會(huì)影響巨噬細(xì)胞的極化�；�于此，研究人員利用小鼠肌內(nèi)植入模型和三種常用的磷酸鈣陶瓷材料，以證明巨噬細(xì)胞極化在材料誘導(dǎo)的骨形成中起著關(guān)鍵作用。

三種CaP陶瓷的骨誘導(dǎo)作用

在這項(xiàng)研究中，研究人員選擇了三種多孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈣陶瓷，包括羥基磷灰石（HA）、雙相磷酸鈣（BCP）和β-磷酸三鈣（β-TCP）。他們通過手術(shù)將多孔CaP圓柱體植入BALB/C小鼠肌肉內(nèi)，并在90天后評估CaP陶瓷的骨誘導(dǎo)作用。少數(shù)HA樣本（2/7）和多數(shù)BCP樣本（6/7）中觀察到異位骨形成。然而，β-TCP樣本中未觀察到骨形成，其孔內(nèi)充滿了纖維狀和脂肪樣組織。

為了評估免疫細(xì)胞浸潤，研究人員在植入后第7、14和21天提取樣本，并通過HE和免疫熒光染色觀察。隨著植入時(shí)間的延長，大量細(xì)胞（尤其是F4/80+ 巨噬細(xì)胞）從CaP陶瓷的表層區(qū)域（區(qū)域1）遷移到內(nèi)部區(qū)域（區(qū)域3）。不過，BCP組的F4/80+ 巨噬細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間急劇減少，而β-TCP組中巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加。

體內(nèi)分析CaP陶瓷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化

研究人員首先對組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，以研究體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化。在植入初期（第7、14和21天），β-TCP組的iNOS+ M1型巨噬細(xì)胞比例最高，而BCP組的ARG+ M2型巨噬細(xì)胞比例最高。對于β-TCP組，他們發(fā)現(xiàn)M1/M2比例逐漸增加，且M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量更多，而BCP組在第7、14和21天都有更多的M2型巨噬細(xì)胞。

圖1. 在植入后對M1和M2表型標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色

之后，他們又利用RT-qPCR技術(shù)評估了M1型標(biāo)志物（iNos）和M2型標(biāo)志物（Arg）的基因表達(dá)。在第7天，BCP組的iNos和Arg mRNA表達(dá)量最低，不過到了第21天，BCP組明顯上調(diào)了Arg基因表達(dá)，并下調(diào)了iNos基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，骨誘導(dǎo)能力出色的BCP陶瓷能夠誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。相反，沒有明顯骨誘導(dǎo)性的β-TCP陶瓷促進(jìn)了iNOS+ M1型巨噬細(xì)胞。

體外分析CaP陶瓷調(diào)控的巨噬細(xì)胞行為

為了深入了解其免疫調(diào)節(jié)特性，研究人員又在體外研究了CaP陶瓷對巨噬細(xì)胞行為的影響。他們利用掃描電鏡觀察了在三種CaP陶瓷上生長的巨噬細(xì)胞的形態(tài)。電鏡圖像表明，HA和BCP上的大多數(shù)巨噬細(xì)胞開始伸長，呈紡錘狀，而β-TCP上的大多數(shù)巨噬細(xì)胞保持球狀或橢圓狀。這些結(jié)果表明，β-TCP陶瓷抑制了巨噬細(xì)胞的擴(kuò)散和伸長。

他們還利用RT-qPCR 分析和多重免疫檢測定量了炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-TCP明顯上調(diào)了M1表型標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β。相反，BCP上調(diào)了M2表型標(biāo)志物（Arg和Il10）的表達(dá)，并增加了CD206+ M2型巨噬細(xì)胞的比例。這些結(jié)果與體內(nèi)研究一致，表明β-TCP和BCP分別將巨噬細(xì)胞推向M1和M2表型，而HA對巨噬細(xì)胞極化沒有偏向。

圖2. 炎性細(xì)胞因子和趨化因子的體外相對表達(dá)

此外，研究人員還分析了巨噬細(xì)胞分泌因子對成骨的影響。他們利用來自巨噬細(xì)胞/CaP上清液的條件培養(yǎng)基來培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）。結(jié)果表明，與純培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基中鈣離子和磷離子的消耗降低了BMSC的增殖。對于HA、BCP和β-TCP組，小鼠BMSC的增殖和成骨基因表達(dá)相當(dāng)。本研究中的BMSC由賽業(yè)生物提供。

總的來說，這些結(jié)果表明，骨科植入物的骨誘導(dǎo)能力與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，這是由植入物調(diào)控的巨噬細(xì)胞極化和功能狀態(tài)決定的。這項(xiàng)研究為了解生物材料的骨誘導(dǎo)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。它也有望幫助人們設(shè)計(jì)出骨誘導(dǎo)支架的新策略。