單細胞的分離具有非常廣泛的應(yīng)用，抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)、單細胞基因組學(xué)到細胞系的開發(fā)。然而面對單細胞克隆分離日益增長的實驗需求，目前常用的方法或從效率方面，或者從可靠性方面并不盡人意：傳統(tǒng)的有限稀釋法基于泊松分布，依賴于統(tǒng)計概率，工作量大且效率低下；基于流式細胞術(shù)的單細胞分選更是由于其低的細胞復(fù)蘇率而被詬病，其次儀器使用還要受累于嚴格的培訓(xùn)，繁復(fù)的清洗和維護工作。盡管如此，這兩種方法都不能從分離的過程中即得到單細胞來源的證明，只能單純依賴孔板掃描成像設(shè)備對結(jié)果拍照以后才能獲得克隆單細胞來源證據(jù)。

Cytena Single-Cell Printer是一款非常高效的單細胞分離設(shè)備，通過Cytena SCP分離單細胞不僅能夠有高的單細胞獲得率，獲得的單細胞的生長率也非常高，儀器通過優(yōu)異的光學(xué)系統(tǒng)，能夠?qū)γ總�成功被獲得的單細胞在分離的過程中跟蹤拍照，留下單細胞來源的證據(jù)，結(jié)合孔板掃描設(shè)備成像結(jié)果，相互佐證單細胞來源，可以使單細胞可靠性高達99.9%。機器使用一次性的耗材，免去了大量的清洗和驗證工作，操作簡單，無需復(fù)雜維護。

下文中介紹了一種單細胞打印機結(jié)合孔板成像的實驗流程，實驗中使用有限稀釋法作平行對照，證明儀器的高效可靠性。

材料和方法：

樣品準(zhǔn)備：
指數(shù)生長期的CHO-K1 細胞 (來源于ATCC)，輕柔離心去除培養(yǎng)基后，重懸于無菌PBS溶液中，密度調(diào)整為1x10⁶cell/mL，為避免細胞團塊兒，在上樣至打印芯片前，通過40um篩網(wǎng)過濾(其他類型細胞處理方法相同)。

Cytena SCP單細胞打印分離：
上樣：取準(zhǔn)備好的細胞樣品60ul加入一次性無菌打印芯片中，芯片安裝好即可以啟動打印過程。
參數(shù)設(shè)定：在開始打印前可以設(shè)定目標(biāo)單細胞的圓度，直徑 和熒光信號強度范圍（F.sight），因為瀕死細胞或不健康細胞的直徑和圓度通常會發(fā)生變化，此功能能夠提高獲得優(yōu)質(zhì)單細胞的概率（見圖1）。如果對細胞的大小圓度或者熒光強度不熟悉，儀器還提供樣品數(shù)據(jù)收集分析功能，可以簡單快速的獲得樣品數(shù)據(jù)的分布情況，以指導(dǎo)設(shè)置合適的參數(shù)區(qū)間。
 

                                                                              圖1

圖2

單細胞分離：儀器使用獲得專利的類似噴墨的柔和分液系統(tǒng)產(chǎn)生均勻液滴，使用雙攝像頭系統(tǒng)分別對液滴進行質(zhì)控和液滴中的細胞進行甄選（F.sight 中的熒光檢測的功能可以對液滴中細胞的熒光強度進行檢測），快速分離到符合要求的單細胞（圖2）至鋪有克隆培養(yǎng)基的384孔板中（儀器也支持96孔板）。
分離的單細胞來源證據(jù): 在對細胞分離篩選的過程中，對于每一個被獲得的單細胞，在其靠近噴嘴區(qū)，系統(tǒng)確認單細胞事件，即對其進行靠近-進入ROI區(qū)域-通過噴嘴區(qū)的過程進行跟蹤拍照，留下單細胞源證據(jù)（圖3）。后續(xù)多孔板在經(jīng)過孔板成像設(shè)備掃描成像后可以與此圖片證據(jù)相互佐證，驗證單細胞的準(zhǔn)確性。

                                                                         圖3
有限稀釋對照：
取準(zhǔn)備好的細胞樣品，通過細胞計數(shù)儀計數(shù)后，使用克隆培養(yǎng)基進行系列稀釋，接種密度為0.3cell/孔，在384孔板中接種80ul細胞稀釋液。

結(jié)果統(tǒng)計與分析：

使用多孔板成像設(shè)備在Day0拍照統(tǒng)計單細胞打印機分離獲得的單細胞率數(shù)據(jù)，之后進行跟蹤拍照至7天后肉眼可見的克隆團出現(xiàn)，統(tǒng)計單克隆生長率。

單細胞率：
使用同一個打印芯片，分了兩個384孔板，平均的單細胞率為92.6%，兩細胞孔和空孔率分別為5.0% and 0.4%（見圖4）,分完每板所用的時間平均為20min。
 

                                                                          圖4
克隆生長率：
分離得到的單細胞的分裂生長能力是很關(guān)鍵的數(shù)據(jù)，體現(xiàn)細胞在經(jīng)過分離過程以后的活力情況，可以驗證分離的方法是否對細胞產(chǎn)生了負面影響，有限稀釋法被認為是對細胞的影響最小的單細胞分離方法。單細胞打印機分選的細胞生長情況（圖5A）：326個孔含有單細胞克隆，5個孔是兩個細胞來源的克隆，32個孔沒有細胞。有限稀釋法的多孔板鋪板后生長到第7天的克隆生長情況（圖5B）：44個孔是單細胞克隆孔，6個孔是多個細胞的克隆孔，334孔是空細胞孔。單細胞打印機分離的單克隆生長率高達84.6%，遠遠高于平行的有限稀釋法（10.5%）（分裂生長的單克隆數(shù)/總的單細胞孔數(shù)*100%）。

                                                                        圖5
結(jié)論：
通過實驗證明，Cytena單細胞打印機可以實現(xiàn)對單細胞的高效分離，獲得高的單細胞率，且分選過程對細胞無損傷。通過軟件對相關(guān)參數(shù)設(shè)定，篩選出狀態(tài)好的細胞，來確保后期的高克隆生長率，同時分離過程留下單細胞來源證據(jù)，非常適合細胞系的開發(fā)工作，提高工作效率。


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