據(jù)估計，美國每年大約有1500萬新發(fā)生的骨折患者，主要是由車禍、運動傷害或工作事故引起。相當一部分的患者（10-15%）會發(fā)生延遲愈合或不愈合，這需要延長治療或重復治療，對治療成本和生活質量都有很大影響。骨折的修復是一個復雜的過程，需要利用內源性的細胞再生潛力來恢復原始的骨骼結構。

間充質干細胞（MSC）的移植已經在一些疾病模型中顯示出治療效果，包括在穩(wěn)定的骨折模型中促進成骨和血管生成。不過，將MSC直接移植到目標組織，仍然存在局限和挑戰(zhàn)。比如，在缺血組織中，移植的干細胞存活率極低。此外，其他相關風險也限制了移植MSC在臨床上幫助骨折愈合，包括免疫排斥、細胞去分化和腫瘤形成。最近的研究表明，旁分泌機制可能參與了MSC在治療多種疾病中的作用，而外泌體（exosomes）可能在此過程中發(fā)揮重要作用。

研究已經證實，外泌體移植表現(xiàn)出的治療效果與直接移植的干細胞相似，但不良反應要少得多。之前的一項研究表明，在心肌梗死模型中，MSC來源的外泌體可促進血管生成。此外，MSC的低氧預處理可以明顯增加其生物學功能和活性，從而提高MSC在各種疾病模型中的移植效力。不過，目前還不清楚低氧條件下的MSC是否能促進骨折愈合，以及這種增強是否通過外泌體信號傳導來介導。

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院的研究人員在《Acta Biomaterialia》雜志上發(fā)表文章，揭示了低氧條件下間充質干細胞來源的外泌體通過轉移miR-126而促進骨折愈合。這些結果表明，低氧預處理可作為一種有效的方法，來優(yōu)化MSC來源的外泌體對骨折愈合的治療作用。

低氧促進外泌體的釋放

研究人員從人類臍帶中分離出人臍帶間充質干細胞（HucMSC），并分別利用Alizarin Red、Oil Red O和Alcian Blue來鑒定HucMSC的成骨、成脂和軟骨分化。在此過程中，他們使用了賽業(yè)生物的OriCell™ 成骨、成脂和軟骨分化培養(yǎng)基。

接下來，他們確定HucMSC的低氧狀況是否會影響它們釋放的外泌體。他們在常氧和低氧（1%CO2）下分別接種HucMSC，孵育48小時后從無血清培養(yǎng)基中分離外泌體，并利用電鏡、納米顆粒追蹤分析（NTA）和western blot進行分析。與常氧對照相比，低氧條件誘導了外泌體釋放的顯著增加。后續(xù)實驗還表明，低氧條件下產生的外泌體更容易被內皮細胞HUVEC吸收。

Hypo-Exo促進血管生成、增殖和遷移

接著，利用小鼠股骨骨折模型，研究人員評估了Hypo-Exo和Exo對骨折愈合的作用。他們利用高分辨率micro-CT掃描后發(fā)現(xiàn)，Hypo-Exo的移植可以促進骨折愈合。為了進一步確定骨折愈合的原因，他們檢測了成骨相關基因（ALP、COLA1和OCN）和血管生成相關基因（VEGF）。結果表明，Hypo-Exo主要通過血管生成而促進骨折愈合。

為了確定Hypo-Exo在體外是否發(fā)揮相似的治療作用，研究人員利用人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）開展體外實驗。細胞增殖分析表明，與Hypo-Exo共同孵育導致HUVEC的增殖顯著增加。同時，細胞遷移分析也表明Hypo-Exo增強了血管形成能力。這些結果表明，與體外的PBS和Exo處理相比，Hypo-Exo可大大促進增殖、遷移和血管形成（圖1）。

圖1. Hypo-Exo在體外促進了HUVEC的細胞增殖、遷移和血管形成

Hypo-Exo中的miR-126上調

之后，研究人員通過實驗證實，來自Hypo-Exo中的miRNA可能發(fā)揮生物學作用，并最終促進骨折愈合。具體是哪個或哪些miRNA？他們開展了miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)Hypo-Exo組中有94個miRNA上調，39個下調。其中，miR-126的表達明顯上調，且已知其對血管生成具有積極作用。于是，他們后續(xù)的研究重點放在miR-126上。

研究人員想了解miR-126是否充當了低氧MSC與HUVEC之間的生物學信使，并可以調節(jié)血管生成。通過一系列體外和體內的功能獲得和功能喪失分析，他們發(fā)現(xiàn)外泌體miR-126的knockdown能夠在體外和體內抑制內皮細胞的增殖，表明miR-126在Hypo-Exo介導的血管生成中發(fā)揮重要功能。通過進一步的分析，他們確認SPRED1是miR-126的目標基因（圖2）。

圖2. miR-126的knockdown在體外和體內抑制了Hypo-Exo介導的細胞增殖、遷移和血管生成

之前的研究表明，低氧誘導因子-1（HIF-1α）對于低氧期間miRNA的表達至關重要。因此，研究人員想了解HIF-1α是否調節(jié)外泌體中的miR-126。通過轉染siRNA，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的下調顯著降低了低氧誘導的miR-126表達。后續(xù)的分析表明，HIF-1α誘導了miR-126的表達及其在外泌體中的負荷。

通過一系列的體內體外實驗，這項研究證實了Hypo-Exo通過外泌體miR-126促進骨折愈合的機制。研究人員認為，低氧可能通過HIF-1α的作用來介導miR-126的產生。因此，低氧預處理是一種有效的方法，有望優(yōu)化MSC來源的外泌體在骨折愈合中的治療作用。