近年來國內(nèi)外關(guān)于干細(xì)胞的研究取得了重大的突破，而這其中最熱門的研究當(dāng)屬間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）。MSC是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體干細(xì)胞，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層未成熟的胚胎結(jié)締組織。1968年德國科學(xué)家Frieden Stein在骨髓中首次發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），后來研究者陸續(xù)在全身多種組織如脂肪、臍帶、牙髓中分離出了MSC。MSC屬于多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，1999年，《科學(xué)》雜志首次報(bào)道了Pittenger等科學(xué)家在體外成功誘導(dǎo)了骨髓MSC分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，此后，科學(xué)家又陸續(xù)成功誘導(dǎo)MSC分化成為肌肉、韌帶、肝、心肌和內(nèi)皮等多種其它細(xì)胞（如下圖）。

 

目前，MSC的鑒定主要通過形態(tài)學(xué)觀察（如呈纖維細(xì)胞樣生長，細(xì)胞中央有卵圓形核，密度較高時(shí)呈渦旋狀或放射狀生長）、表面標(biāo)志物檢測（如CD29、CD44等）以及多系分化潛能鑒定。這里的多系分化潛能通常指成骨、成脂和成軟骨分化，稱為MSC的三系分化。雖然目前MSC三系分化的誘導(dǎo)過程和鑒定方法都已經(jīng)相對成熟，但三系分化的原理可能還未被大家所熟知。為了更好地理解MSC的三系分化，本文初步總結(jié)了MSC三系分化的大概過程，分化過程中出現(xiàn)的一些標(biāo)志物以及對應(yīng)的檢測方法。

 

1 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化

間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化是理解骨形成機(jī)制的有力工具，它也被用于鑒別骨質(zhì)疏松癥、骨修復(fù)和成骨不全等遺傳紊亂疾病。

 

同其他組織器官一樣，骨組織也在不斷地進(jìn)行著細(xì)胞代謝，稱為骨代謝。它可以大致分為骨形成和骨重塑兩個(gè)階段，前者在個(gè)體生長發(fā)育期起主要作用，后者則持續(xù)整個(gè)生命周期。成骨分化是骨生成的關(guān)鍵步驟，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)歷骨原細(xì)胞（osteoprogenitor cells）、成骨前體細(xì)胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨細(xì)胞（osteoblasts）和終末階段的骨細(xì)胞（osteocytes）的一個(gè)復(fù)雜的過程，其中涉及到多種類型細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，如信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、MicroRNA 等，形成了一個(gè)完整的骨代謝調(diào)控負(fù)反饋環(huán)路。不同階段的細(xì)胞群之間無明顯的界限，它們是一個(gè)連續(xù)發(fā)生發(fā)展的過程。具體過程如下：

1）多種刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為骨原細(xì)胞；

2）其后，骨原細(xì)胞進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，進(jìn)入快速增殖期;

3）細(xì)胞增殖能力逐漸下降，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）成熟相關(guān)基因（堿性磷酸酶、I型膠原、基質(zhì)鈣蛋白）被進(jìn)一步激活，成骨細(xì)胞在此階段合成和分泌有機(jī)基質(zhì)，形成類骨質(zhì)，主要由I型膠原形成，特征物是堿性磷酸酶，是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志；

4）成熟的成骨細(xì)胞表達(dá)ECM鈣化相關(guān)蛋白，主要是骨鈣蛋白和骨橋蛋白，成骨細(xì)胞礦化活力顯著升高。

 

與成骨分化的體內(nèi)過程相對應(yīng)的，體外誘導(dǎo)成骨分化的鑒定主要是通過檢測成骨細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志以及相關(guān)的標(biāo)志基因來進(jìn)行的。短期的成骨分化可通過堿性磷酸酶來檢測，長期的成骨分化則通過檢測茜紅素染色骨結(jié)節(jié)來鑒定。具體檢測以下三種物質(zhì)：

1）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）：堿性磷酸酶經(jīng)固藍(lán)染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色，未分化的細(xì)胞則無明顯顏色�？赏ㄟ^統(tǒng)計(jì)各樣品中細(xì)胞堿性磷酸酶的平均表達(dá)強(qiáng)度對其成骨能力進(jìn)行評估對比�？赏ㄟ^統(tǒng)計(jì)各樣品中成骨分化細(xì)胞的百分比加以對比或統(tǒng)計(jì)ALP染色照片的平均灰度（固定各項(xiàng)拍攝參數(shù)）進(jìn)行對比，還可通過溶解藍(lán)色物質(zhì)后測吸光度。

2）“鈣結(jié)節(jié)”：長時(shí)間的成骨誘導(dǎo)會(huì)使鈣離子以鈣鹽方式沉淀下來，形成“骨結(jié)節(jié)”。骨結(jié)節(jié)可通過茜素紅染色（茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色化合物），把外面沉積的鈣結(jié)節(jié)染成深紅色，通過著色物面積和深淺來表示成骨分化的強(qiáng)弱。

3）MSC成骨分化后明顯的成骨細(xì)胞特征性基因，如ALP，Runx（runt related gene II）等。可使用RT-PCR對比不同實(shí)驗(yàn)組別的成骨分化差異。

賽業(yè)生物長期致力于干細(xì)胞領(lǐng)域的研究，在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗(yàn)，依賴于成熟的干細(xì)胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細(xì)

胞成骨誘導(dǎo)分化潛能研究的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。下圖是賽業(yè)所做的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo)圖，圖中深紅色部分為鈣結(jié)節(jié)。

 

2 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化

脂肪組織由脂肪細(xì)胞組成，對保持能量和代謝平衡非常重要。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織（WAT），主要分布在皮下和內(nèi)臟，內(nèi)臟白色脂肪與肥胖、病理驗(yàn)證和胰島素抵抗相關(guān)，皮下白色脂肪則可提高葡萄糖耐受性；另一種為棕色脂肪組織（BAT），主要呈離散狀分布在脊椎旁、鎖骨和腎上腺，功能是產(chǎn)熱。這兩種脂肪組織有相同的分化特征，都是由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來。

 

間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化有兩個(gè)階段，先是MSC分化為脂肪前體細(xì)胞，接著在特定的細(xì)胞刺激影響下（如C/EBPs和PPAR-γ）最終分化為脂肪細(xì)胞，出現(xiàn)脂肪細(xì)胞中顯著的標(biāo)志物（脂肪滴），如下圖：

 

體外誘導(dǎo)成脂分化的鑒定

1.檢測成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞的胞漿中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴經(jīng)油紅O染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)顯著的紅色，未分化細(xì)胞則無明顯顏色。通過統(tǒng)計(jì)各樣品中成脂分化細(xì)胞的百分比來對成脂分化強(qiáng)弱加以表征對比。

2.MSC成脂分化后有明顯的成脂特征性基因表達(dá)，如LPL、PPARγ等�？墒褂肦T-PCR通過對相關(guān)基因表達(dá)量的測量，對比不同實(shí)驗(yàn)組別的成脂分化差異。

 

賽業(yè)生物長期致力于干細(xì)胞領(lǐng)域的研究，在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗(yàn)，依賴于成熟的干細(xì)胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化潛能研究的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。下圖是公司所做骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化誘導(dǎo)圖，可以看到圖中有明顯的脂肪滴。

 

3 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化

軟骨的破壞、缺失是包括骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）在內(nèi)的多種骨科疾病的重要病理改變。由于軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復(fù)能力異常不足，因此通過人工方法修復(fù)軟骨破壞具有重要臨床意義。近年來，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究深入，其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在軟骨修復(fù)應(yīng)用中具有令人期待的潛力。

 

MSC成軟骨分化的過程：MSC首先收回其突起，聚集成團(tuán)，這個(gè)團(tuán)中間的細(xì)胞經(jīng)分裂分化轉(zhuǎn)變成一種大而圓的細(xì)胞，即成軟骨細(xì)胞；成軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)和纖維（主要為II型膠原蛋白），當(dāng)基質(zhì)的量增加到一定程度時(shí)，成軟骨細(xì)胞被分隔在陷窩內(nèi)，分化為成熟的軟骨細(xì)胞。

 

體外誘導(dǎo)成軟骨分化的鑒定主要圍繞成軟骨的標(biāo)志物——II型膠原蛋白來進(jìn)行，包括通過免疫組化、Westernblot檢測II型膠原蛋白的表達(dá)和RT-PCR檢測II型膠原蛋白的mRNA的表達(dá)，不同的角度進(jìn)行鑒定；而甲苯胺藍(lán)則主要檢測成軟骨細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖。

 

賽業(yè)生物長期致力于干細(xì)胞領(lǐng)域的研究，在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗(yàn)，依賴于成熟的干細(xì)胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化潛能研究的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。下圖是公司所做骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化誘導(dǎo)圖，可以看到軟骨細(xì)胞埋藏在軟骨間質(zhì)內(nèi)，它所存在的部位為一小腔，稱為軟骨陷窩（cartilage lacuna）。

 

自我更新能力和多向分化能力是干細(xì)胞的兩個(gè)最基本特征。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化是干細(xì)胞鑒定的主要方法，也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑。賽業(yè)生物長期致力于干細(xì)胞領(lǐng)域的研究，在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗(yàn)，依賴于成熟的干細(xì)胞技術(shù)平臺，我們可以為您開展多種干細(xì)胞分化潛能研究的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。其中OriCell®干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基針對干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化添加了特殊的誘導(dǎo)物質(zhì)，能高效促進(jìn)干細(xì)胞分化；同時(shí)，針對不同種屬和來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）公司研發(fā)出了相應(yīng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞檢測試劑盒、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞檢測試劑盒、小鼠充質(zhì)干細(xì)胞檢測試劑盒，以滿足大多數(shù)科研工作者的需要。

 

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