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COVID-19實(shí)驗(yàn)室診斷方法選擇和新技術(shù)展望

瀏覽次數(shù):2351 發(fā)布日期:2020-9-15  來源:微信公眾號(hào)- 閑談 Immunology
COVID-19從2019年末到現(xiàn)在,影響者我們每一個(gè)人。我們每一位生物醫(yī)藥人,也都在不同行業(yè)為新冠抗疫努力著。


閑談Immunology新冠相關(guān)文章回顧

2013年作者因?yàn)楣ぷ餍枰,一直在甲流H7N9防控的第一線,形成一個(gè)直覺:流感或其他呼吸道病原體,如果引起呼吸窘迫多與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)。
因而于2月5日,在公眾號(hào)發(fā)表:細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征臨床特點(diǎn)及治療藥物; 有超過1.2萬人閱讀,之后多個(gè)公眾號(hào)轉(zhuǎn)載,累計(jì)超過10萬人閱讀。


2月12日發(fā)表:泛冠狀病毒藥物開發(fā)的基礎(chǔ)知識(shí),希望能夠給藥物研發(fā)的科學(xué)工作者,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到策略選擇提供一些參考。

2月17日發(fā)表:病毒免疫逃逸機(jī)制--誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡、衰老和耗竭,警示小心病毒通過各種機(jī)制逃避免疫,和病毒的戰(zhàn)斗是一個(gè)長(zhǎng)期的過程。


之前的人感染冠狀病毒,呈季節(jié)性流行趨勢(shì),多從12月開始,次年4月慢慢結(jié)束,對(duì)溫濕度較為敏感,參考閱讀:呼吸道病毒季節(jié)性流行的原因與預(yù)防

SARS-CoV-2夏季,在我國(guó)之外大范圍流行,顯示這個(gè)規(guī)律被打破了,專家也提示,我們可能需要長(zhǎng)時(shí)間關(guān)注SARS-CoV-2流行,做好個(gè)人防護(hù)。


近日作者又著手開始寫一些新冠的文章,希望大家一起來關(guān)注和回過來思考一些問題:

大范圍人群疫苗免疫后,新冠病毒再度流行時(shí),是否會(huì)因?yàn)锳DE而增加感染。8月26日發(fā)表:抗體依賴增強(qiáng)作用(ADE)免疫學(xué)基礎(chǔ)和抗體疫苗開發(fā)的提示。


COVID-19實(shí)驗(yàn)室診斷

SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室診斷,主要涵蓋核酸檢測(cè)(qPCR,測(cè)序,核酸等溫?cái)U(kuò)增),抗原免疫學(xué)檢測(cè)(膠體金法為主),血清抗體免疫學(xué)檢測(cè)(膠體金或ELISA法),細(xì)胞因子風(fēng)暴伴隨診斷(ELISA法,或者Luminex多因子檢測(cè)等)。
 



核酸檢測(cè)

基因測(cè)序

對(duì)于任何新發(fā)未知傳染病,需第一時(shí)間分離病毒株,進(jìn)行基因測(cè)序。1. 得到準(zhǔn)確的基因序列,是后續(xù)qPCR法,抗原抗體研發(fā),和免疫檢測(cè)研發(fā)的基礎(chǔ)。2. 從進(jìn)化樹上,追溯其可能來源。3. 明確病人是否多種病原體感染同時(shí)并存。
 



但是基因測(cè)序,對(duì)操作人員和分析人員要求高,時(shí)間長(zhǎng),成本高,不適合人群篩查。因而后續(xù)多轉(zhuǎn)用PCR法。大型實(shí)驗(yàn)室,可以采用定量PCR(qPCR),社區(qū)或者野外,可以采用便攜式PCR等。

定量RT-PCR(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)

獲得基因序列后,可以在極短的時(shí)間內(nèi),設(shè)計(jì)特異性引物,通過qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。通常,也是臨床上最早可以獲得的,進(jìn)行大規(guī)模人群篩查的方法。

qRT-PCR特點(diǎn)
  • 方法靈敏度足夠高,可以達(dá)到10拷貝/ml 以下(文獻(xiàn)1),

  • 時(shí)間約2-4小時(shí)

  • 疫情早期診斷主要方法(抗原抗體的開發(fā)需要時(shí)間)

  • 假陰性(CT影像診斷陽性,核酸陰性)可能原因:突變引起的引物脫靶;鼻咽拭子取樣問題;樣本運(yùn)輸問題等



環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)
LAMP作為POCT式的核酸檢測(cè)設(shè)備,在傳染病爆發(fā)期,可以大大增加檢測(cè)可及性(尤其是在技術(shù)欠發(fā)達(dá)地區(qū),交通樞紐,機(jī)場(chǎng)等),以及檢測(cè)及時(shí)性。
  • RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10拷貝

  • 60-65℃等溫?cái)U(kuò)增

  • 時(shí)間約15-40分鐘

  • 儀器價(jià)格較qRT-PCR低



CRISPR-Cas RNA鑒定系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)是鑒定平臺(tái),主要用于鑒定RT-PCR或者RT-LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物。具體原理和過程見下圖。

CRISPR-Cas聯(lián)合RT-LAMP技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)LoD:10拷貝/μL ,(90% 靈敏度100% 準(zhǔn)確度)

圖片來源于文獻(xiàn)3

 

免疫學(xué)檢測(cè)

 

獲取基因序列之后,大量的上游原料廠商開始表達(dá)抗原,研發(fā)抗體。隨即抗原和抗體檢測(cè)試劑快速開發(fā)。主要的檢測(cè)方法有ELISA法,膠體金法,化學(xué)發(fā)光法,免疫熒光法等。其中膠體金法,作為POCT的方法,使用最為廣泛。

抗原檢測(cè)(膠體金法)
國(guó)內(nèi)有多個(gè)產(chǎn)品上市,例如:
  • 東方基因(Healgen)新型冠狀病毒快速檢測(cè)試紙(膠體金免疫層析法);

  • 萬孚生物(wondfo)2019-nCoV新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑(免疫層析法);

  • 重慶業(yè)為基COVID-19新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)

特點(diǎn)
  • 快速:全程10-15分鐘

  • 早期:和核酸一致

  • 便利:無需儀器配套

  • 靈敏度:5-10 TCID50/test

  • 缺點(diǎn):靈敏度不如核酸qRT-PCR法

  • 用途:呼吸道病毒鑒別診斷



抗體檢測(cè)(膠體金法)
用于回顧性檢測(cè),流行病學(xué)調(diào)查。

因?yàn)槊庖吡鞒蹋腥境跗诓⒉怀霈F(xiàn)抗體,因而不適合疾病的早期篩查。一般適用于疾病的回顧性檢測(cè),流行病學(xué)調(diào)查。另外,因?yàn)榧膊∠撕,抗原和核酸消失,但是抗體IgM和IgG半衰期長(zhǎng),因而回顧性研究,可以使用抗體血清學(xué)檢測(cè)。

新冠IgM/IgG抗體檢測(cè)試劑盒,有更多的廠家(萬孚,麗珠試劑等)提供,不做贅述。


細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測(cè)
細(xì)胞因子風(fēng)暴是新冠肺炎病情危重的重要因素,因而在新冠肺炎診療方案中建議:有條件者可行細(xì)胞因子檢測(cè)。
細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測(cè)組合包含:IL-1β,IL-17A,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α,IFN-γ,MCP-1,IP-10,GM-CSF等。

細(xì)胞因子本是Roche,西門子等體外診斷巨頭已有檢測(cè)項(xiàng)目,但多年來并不受關(guān)注,甚至沒有相關(guān)組合試劑提供,尤其是可以檢測(cè)所有項(xiàng)目的組合試劑。
在本次新冠期間,經(jīng)典的多因子檢測(cè)品牌Luminex和基于流式細(xì)胞術(shù)的多因子檢測(cè)在臨床上占據(jù)了主導(dǎo)位置。

未來,傳統(tǒng)巨頭是否會(huì)增強(qiáng)其細(xì)胞因子檢測(cè)平臺(tái),尤其是試劑提供嗎?畢竟,除了新冠,甲流等;CAR-T治療,免疫檢查點(diǎn)治療副作用檢測(cè),細(xì)胞因子風(fēng)暴也是非常重要的項(xiàng)目,是有一定市場(chǎng)體量的。

未來技術(shù)展望

新冠防控的薄弱點(diǎn)是人群聚集的公共區(qū)域,如菜市場(chǎng),商城,交通工具等。如何對(duì)公共區(qū)域進(jìn)行檢測(cè),是一個(gè)難點(diǎn),國(guó)內(nèi)清華伯克利深圳研究院,南方科技大學(xué),聯(lián)合羅切斯特理工學(xué)院的科學(xué)家,在ACS  infection disease上的文章,給了很多開創(chuàng)性的思路,如下圖,供大家參考。


 

喵評(píng):上述方法,其實(shí)大家早已熟知。梳理一遍,主要幫大家了解不同技術(shù)的使用和開發(fā)背景。如果,有科學(xué)家能夠開發(fā)出公共區(qū)域病毒采集檢測(cè)預(yù)警系統(tǒng),將會(huì)極大幫助現(xiàn)在和未來新發(fā)傳染病的公共預(yù)防控制。

 

參考文獻(xiàn)

  1. Chan, J. F.-W.,, et al. (2020) Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated in Vitro and with Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 58,e00310-20.

  2. Robin Augustine, et al, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Care Test for Coronaviruses in the Context of COVID-19 Pandemic, Biology 2020, 9, 182

  3. MEAGAN N. ESBIN et al, Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection,RNA (2020) 26:771–783

  4. D'Cruz RJ, Currier AW, Sampson VB,Laboratory Testing Methods for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2),F(xiàn)ront Cell Dev Biol . 2020 Jun 4;8:468

  5. Xi Yuan, Chengming Yang, Qian He, Junhu Chen, Dongmei Yu, Jie Li, Shiyao Zhai, Zhifeng Qin, Ke Du,Zhenhai Chu,and Peiwu Qin,Current and Perspective Diagnostic Techniques for COVID-19,ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1998−2016


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