COVID-19從2019年末到現(xiàn)在，影響者我們每一個(gè)人。我們每一位生物醫(yī)藥人，也都在不同行業(yè)為新冠抗疫努力著。


閑談Immunology新冠相關(guān)文章回顧

2013年作者因?yàn)楣ぷ餍枰�，一直在甲流H7N9防控的第一線，形成一個(gè)直覺：流感或其他呼吸道病原體，如果引起呼吸窘迫多與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)。
因而于2月5日，在公眾號(hào)發(fā)表：細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征臨床特點(diǎn)及治療藥物; 有超過1.2萬人閱讀，之后多個(gè)公眾號(hào)轉(zhuǎn)載，累計(jì)超過10萬人閱讀。


2月12日發(fā)表：泛冠狀病毒藥物開發(fā)的基礎(chǔ)知識(shí)，希望能夠給藥物研發(fā)的科學(xué)工作者，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到策略選擇提供一些參考。

2月17日發(fā)表：病毒免疫逃逸機(jī)制--誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡、衰老和耗竭，警示小心病毒通過各種機(jī)制逃避免疫，和病毒的戰(zhàn)斗是一個(gè)長(zhǎng)期的過程。


之前的人感染冠狀病毒，呈季節(jié)性流行趨勢(shì)，多從12月開始，次年4月慢慢結(jié)束，對(duì)溫濕度較為敏感，參考閱讀：呼吸道病毒季節(jié)性流行的原因與預(yù)防

SARS-CoV-2夏季，在我國(guó)之外大范圍流行，顯示這個(gè)規(guī)律被打破了，專家也提示，我們可能需要長(zhǎng)時(shí)間關(guān)注SARS-CoV-2流行，做好個(gè)人防護(hù)。


近日作者又著手開始寫一些新冠的文章，希望大家一起來關(guān)注和回過來思考一些問題：

大范圍人群疫苗免疫后，新冠病毒再度流行時(shí)，是否會(huì)因?yàn)锳DE而增加感染。8月26日發(fā)表：抗體依賴增強(qiáng)作用（ADE）免疫學(xué)基礎(chǔ)和抗體疫苗開發(fā)的提示。


COVID-19實(shí)驗(yàn)室診斷

SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室診斷，主要涵蓋核酸檢測(cè)（qPCR，測(cè)序，核酸等溫?cái)U(kuò)增），抗原免疫學(xué)檢測(cè)（膠體金法為主），血清抗體免疫學(xué)檢測(cè)（膠體金或ELISA法），細(xì)胞因子風(fēng)暴伴隨診斷（ELISA法，或者Luminex多因子檢測(cè)等）。
 

核酸檢測(cè)

基因測(cè)序

對(duì)于任何新發(fā)未知傳染病，需第一時(shí)間分離病毒株，進(jìn)行基因測(cè)序。1. 得到準(zhǔn)確的基因序列，是后續(xù)qPCR法，抗原抗體研發(fā)，和免疫檢測(cè)研發(fā)的基礎(chǔ)。2. 從進(jìn)化樹上，追溯其可能來源。3. 明確病人是否多種病原體感染同時(shí)并存。
 

但是基因測(cè)序，對(duì)操作人員和分析人員要求高，時(shí)間長(zhǎng)，成本高，不適合人群篩查。因而后續(xù)多轉(zhuǎn)用PCR法。大型實(shí)驗(yàn)室，可以采用定量PCR（qPCR），社區(qū)或者野外，可以采用便攜式PCR等。

定量RT-PCR（Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）

獲得基因序列后，可以在極短的時(shí)間內(nèi)，設(shè)計(jì)特異性引物，通過qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。通常，也是臨床上最早可以獲得的，進(jìn)行大規(guī)模人群篩查的方法。

qRT-PCR特點(diǎn)

• 方法靈敏度足夠高，可以達(dá)到10拷貝/ml 以下（文獻(xiàn)1），

• 時(shí)間約2-4小時(shí)

• 疫情早期診斷主要方法（抗原抗體的開發(fā)需要時(shí)間）

• 假陰性（CT影像診斷陽性，核酸陰性）可能原因：突變引起的引物脫靶；鼻咽拭子取樣問題；樣本運(yùn)輸問題等

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）
LAMP作為POCT式的核酸檢測(cè)設(shè)備，在傳染病爆發(fā)期，可以大大增加檢測(cè)可及性（尤其是在技術(shù)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，交通樞紐，機(jī)場(chǎng)等），以及檢測(cè)及時(shí)性。

• RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10拷貝

• 60-65℃等溫?cái)U(kuò)增

• 時(shí)間約15-40分鐘

• 儀器價(jià)格較qRT-PCR低

CRISPR-Cas RNA鑒定系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)是鑒定平臺(tái)，主要用于鑒定RT-PCR或者RT-LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物。具體原理和過程見下圖。

CRISPR-Cas聯(lián)合RT-LAMP技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)LoD：10拷貝/μL ，（90% 靈敏度100% 準(zhǔn)確度）

圖片來源于文獻(xiàn)3

 

免疫學(xué)檢測(cè)

 

獲取基因序列之后，大量的上游原料廠商開始表達(dá)抗原，研發(fā)抗體。隨即抗原和抗體檢測(cè)試劑快速開發(fā)。主要的檢測(cè)方法有ELISA法，膠體金法，化學(xué)發(fā)光法，免疫熒光法等。其中膠體金法，作為POCT的方法，使用最為廣泛。

抗原檢測(cè)（膠體金法）
國(guó)內(nèi)有多個(gè)產(chǎn)品上市，例如：

• 東方基因（Healgen)新型冠狀病毒快速檢測(cè)試紙（膠體金免疫層析法）；

• 萬孚生物（wondfo）2019-nCoV新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑（免疫層析法）；

• 重慶業(yè)為基COVID-19新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）

特點(diǎn)：

• 快速：全程10-15分鐘

• 早期：和核酸一致

• 便利：無需儀器配套

• 靈敏度：5-10 TCID50/test

• 缺點(diǎn)：靈敏度不如核酸qRT-PCR法

• 用途：呼吸道病毒鑒別診斷

抗體檢測(cè)（膠體金法）
用于回顧性檢測(cè)，流行病學(xué)調(diào)查。

因?yàn)槊庖吡鞒蹋�感染初期并不出現(xiàn)抗體，因而不適合疾病的早期篩查。一般適用于疾病的回顧性檢測(cè)，流行病學(xué)調(diào)查。另外，因?yàn)榧膊∠�退后，抗原和核酸消失，但是抗體IgM和IgG半衰期長(zhǎng)，因而回顧性研究，可以使用抗體血清學(xué)檢測(cè)。

新冠IgM/IgG抗體檢測(cè)試劑盒，有更多的廠家（萬孚，麗珠試劑等）提供，不做贅述。


細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測(cè)
細(xì)胞因子風(fēng)暴是新冠肺炎病情危重的重要因素，因而在新冠肺炎診療方案中建議：有條件者可行細(xì)胞因子檢測(cè)。
細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測(cè)組合包含：IL-1β，IL-17A，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，IFN-γ，MCP-1，IP-10，GM-CSF等。

細(xì)胞因子本是Roche，西門子等體外診斷巨頭已有檢測(cè)項(xiàng)目，但多年來并不受關(guān)注，甚至沒有相關(guān)組合試劑提供，尤其是可以檢測(cè)所有項(xiàng)目的組合試劑。
在本次新冠期間，經(jīng)典的多因子檢測(cè)品牌Luminex和基于流式細(xì)胞術(shù)的多因子檢測(cè)在臨床上占據(jù)了主導(dǎo)位置。

未來，傳統(tǒng)巨頭是否會(huì)增強(qiáng)其細(xì)胞因子檢測(cè)平臺(tái)，尤其是試劑提供嗎？畢竟，除了新冠，甲流等；CAR-T治療，免疫檢查點(diǎn)治療副作用檢測(cè)，細(xì)胞因子風(fēng)暴也是非常重要的項(xiàng)目，是有一定市場(chǎng)體量的。

未來技術(shù)展望

新冠防控的薄弱點(diǎn)是人群聚集的公共區(qū)域，如菜市場(chǎng)，商城，交通工具等。如何對(duì)公共區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，是一個(gè)難點(diǎn)，國(guó)內(nèi)清華伯克利深圳研究院，南方科技大學(xué)，聯(lián)合羅切斯特理工學(xué)院的科學(xué)家，在ACS  infection disease上的文章，給了很多開創(chuàng)性的思路，如下圖，供大家參考。

 

喵評(píng)：上述方法，其實(shí)大家早已熟知。梳理一遍，主要幫大家了解不同技術(shù)的使用和開發(fā)背景。如果，有科學(xué)家能夠開發(fā)出公共區(qū)域病毒采集檢測(cè)預(yù)警系統(tǒng)，將會(huì)極大幫助現(xiàn)在和未來新發(fā)傳染病的公共預(yù)防控制。

 

參考文獻(xiàn)

1. Chan, J. F.-W.,, et al. (2020) Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated in Vitro and with Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 58,e00310-20.

2. Robin Augustine, et al, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Care Test for Coronaviruses in the Context of COVID-19 Pandemic, Biology 2020, 9, 182

3. MEAGAN N. ESBIN et al, Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection,RNA (2020) 26:771–783

4. D'Cruz RJ, Currier AW, Sampson VB，Laboratory Testing Methods for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)，F(xiàn)ront Cell Dev Biol . 2020 Jun 4;8:468

5. Xi Yuan, Chengming Yang, Qian He, Junhu Chen, Dongmei Yu, Jie Li, Shiyao Zhai, Zhifeng Qin, Ke Du,Zhenhai Chu,and Peiwu Qin，Current and Perspective Diagnostic Techniques for COVID-19，ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1998−2016