不知道你有沒(méi)有注意到：細(xì)胞消化過(guò)后，仍有些細(xì)胞分散不開(kāi)，吹又不敢吹，棄又棄不凈？結(jié)果聚團(tuán)細(xì)胞像滾雪球一樣越聚越大、越聚越多？此時(shí)只想說(shuō)一句：

 

細(xì)胞聚團(tuán)到底是不小心污染了？還是操作失誤？聚團(tuán)細(xì)胞該怎么計(jì)數(shù)？

 

One   為什么細(xì)胞喜歡“抱團(tuán)”

首先要明確一點(diǎn)，常規(guī)的“抱團(tuán)”是指貼壁細(xì)胞被消化后懸浮狀態(tài)下的聚集情況。細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)時(shí)，聚集在一起是正�，F(xiàn)象。當(dāng)周圍細(xì)胞寥寥無(wú)幾，而這一團(tuán)已經(jīng)疊層生長(zhǎng)，這就是在懸浮狀態(tài)就已經(jīng)聚團(tuán)的細(xì)胞再貼壁導(dǎo)致的。相同條件下，培養(yǎng)的癌細(xì)胞對(duì)密度依賴性的生長(zhǎng)抑制敏感性降低，所以即使在形成單層后，也不會(huì)停止生長(zhǎng)，而是相互堆積形成多層生長(zhǎng)的聚集體。

其次，部分細(xì)胞被污染后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞聚團(tuán)，這和操作有很大關(guān)系，比如：傳代鋪板時(shí)，是否進(jìn)行了活細(xì)胞計(jì)數(shù)并及時(shí)調(diào)整濃度；終止消化時(shí)間點(diǎn)是否準(zhǔn)確；混勻是否過(guò)于輕柔或粗暴；胰酶是否濃度過(guò)高；離心收集時(shí)，加速度是否過(guò)大等，都會(huì)直接影響子代細(xì)胞狀態(tài)。

 

另外，過(guò)度消化細(xì)胞、狀態(tài)不好的老化細(xì)胞也可能會(huì)出現(xiàn)聚團(tuán)。很多人覺(jué)得細(xì)胞多多益善，經(jīng)常將貼壁細(xì)胞養(yǎng)到疊層、或密集程度特別高時(shí)才進(jìn)行傳代，如果一直這樣，不僅會(huì)縮短傳代時(shí)間，導(dǎo)致操作密集；同時(shí)細(xì)胞的老化會(huì)更加嚴(yán)重。另外，細(xì)胞死亡時(shí)釋放DNA，會(huì)“抓住”其他細(xì)胞，形成黏性的細(xì)胞團(tuán)，若不及時(shí)處理，整體細(xì)胞狀態(tài)會(huì)惡性循環(huán)。

Two   聚團(tuán)細(xì)胞狀態(tài)都不好嗎

 

若細(xì)胞輪廓清晰，胞體通透，呈串狀均勻聚集，證明其狀態(tài)較好，正在分裂。但是大多數(shù)情況下，聚團(tuán)細(xì)胞都是輪廓模糊，細(xì)胞透光性差，甚至出現(xiàn)合胞體，同時(shí)伴有細(xì)胞碎片，這證明細(xì)胞已經(jīng)衰老或者產(chǎn)生病變，狀態(tài)不佳。
 

Three   如何避免聚團(tuán)細(xì)胞的生成

首先確認(rèn)當(dāng)前細(xì)胞生長(zhǎng)密度及狀態(tài)，80%左右的生長(zhǎng)密度即可進(jìn)行傳代，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好，且用于傳代的數(shù)量也足夠。

傳代操作前，使用緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)且全面地潤(rùn)洗，清除死亡的細(xì)胞團(tuán)和部分堆疊雜質(zhì)（在選擇適當(dāng)胰酶濃度時(shí)，對(duì)于不同代數(shù)的不同細(xì)胞系需進(jìn)行一定的調(diào)整，如：部分貼壁牢固的細(xì)胞應(yīng)將胰酶分裝后，進(jìn)行預(yù)熱處理；細(xì)胞密度過(guò)高時(shí)，應(yīng)該向胰酶中加入少量緩沖液，緩慢均勻地消化細(xì)胞等。對(duì)于貼壁格外牢固的細(xì)胞，可以嘗試多次分批進(jìn)行消化，最大限度保證細(xì)胞狀態(tài)）。

在消化過(guò)程中，需均勻慢速晃動(dòng)培養(yǎng)器皿，以免局部胰酶濃度過(guò)高而影響傳代。切勿用力搖動(dòng)，導(dǎo)致邊緣松動(dòng)的大片細(xì)胞直接脫落，從而增加細(xì)胞成團(tuán)幾率。

 

培養(yǎng)器皿的選擇也需注意，部分實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用玻璃培養(yǎng)瓶，因細(xì)胞貼壁在玻璃底更容易分離。同時(shí)玻璃材質(zhì)的親水性和塑料有區(qū)別，而且玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶都是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部處理，可能會(huì)有清潔殘留，在一定程度上抑制細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，并且更容易消化，細(xì)胞之間的連接比貼壁還要緊密，聚團(tuán)幾率很大。

 

另外，避免傳代過(guò)程中匯合度較大，本身1:3甚至1:4都可以正常培養(yǎng)的細(xì)胞被1:2傳代，會(huì)導(dǎo)致母代細(xì)胞濃度過(guò)高，在分化過(guò)程中出現(xiàn)堆疊現(xiàn)象，所以在每次細(xì)胞傳代前要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

 

 

Four已經(jīng)聚團(tuán)的細(xì)胞，只能棄掉嗎

如果預(yù)實(shí)驗(yàn)比較緊急，或者細(xì)胞株較為珍貴，也可以在復(fù)蘇新細(xì)胞的同時(shí)，進(jìn)行聚團(tuán)細(xì)胞“拯救”。

首先，將帶有聚團(tuán)細(xì)胞的樣品低密度連續(xù)傳代，約三代過(guò)后，可逐漸分散為獨(dú)立個(gè)體，再通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力狀態(tài)，判斷是否可用來(lái)進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。若肉眼可見(jiàn)，即可直接通過(guò)清洗和吸出，或是在消化后將懸起的細(xì)胞樣品靜置數(shù)十秒以沉淀團(tuán)塊。對(duì)于死細(xì)胞聚團(tuán)，可以在細(xì)胞液中適量加入DNase以斷裂DNA。

其次，若發(fā)現(xiàn)珍貴細(xì)胞株雖有聚團(tuán)，但對(duì)整體生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，短期不會(huì)做其它處理，只是計(jì)數(shù)時(shí)較為麻煩，怎么辦？人工手動(dòng)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度無(wú)法保證，且血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中一旦出現(xiàn)聚團(tuán)細(xì)胞，樣品需要重新制備，有沒(méi)有可以對(duì)帶有聚團(tuán)細(xì)胞分析的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀呢？

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