病毒侵染動(dòng)態(tài)研究莫發(fā)愁，徠卡FLIM-FRET顯身手

齊瑤

研究難點(diǎn)

病毒是一種個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單、只含一種核酸（DNA或RNA）、必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型生物。而病毒侵染宿主細(xì)胞卻是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，主要分為吸附（Attachment）、進(jìn)入（Entry/Penetration）、復(fù)制（Replication）、大分子合成（Biosynthesis）、裝配（Assembly）、釋放（Release）等幾個(gè)階段，如圖1。

圖1.HIV病毒侵染人源細(xì)胞過程示意圖^[1]

如何從初始的吸附和進(jìn)入階段進(jìn)行干預(yù)阻斷，是病毒性疾病防治的切入點(diǎn)之一。以人類免疫缺陷病毒（HIV），也就是引發(fā)艾滋病的病原為例，它通過顆粒表面的包膜糖蛋白（Env）與免疫細(xì)胞表面的CD4分子、輔助受體互作，實(shí)現(xiàn)病毒與宿主細(xì)胞的融合、感染過程。科學(xué)家們曾運(yùn)用BlaM（β-內(nèi)酰胺酶分析：測量細(xì)胞群中病毒融合的技術(shù)）或細(xì)胞內(nèi)病毒衣殼蛋白p24分析等多種方法對病毒的侵染過程進(jìn)行檢測，但由于技術(shù)的限制，均不能直接實(shí)時(shí)監(jiān)測病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)融合過程^[2]。因此，在時(shí)間和空間上都具備高靈敏度的FLIM-FRET，成為了該項(xiàng)研究的破冰技術(shù)。

FLIM-FRET

經(jīng)常關(guān)注徠卡課堂的同學(xué)們，想必對FLIM-FRET都不陌生了。在這里，我們再簡單回顧一下幾個(gè)關(guān)鍵性的概念。

熒光壽命：熒光是指熒光分子吸收能量后，其處于基態(tài)（S₀）的電子躍遷至激發(fā)態(tài)（S₁），經(jīng)過短暫停留，由激發(fā)態(tài)（S₁）再回到基態(tài)（S₀）時(shí)釋放出光的現(xiàn)象，而熒光分子停留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間就是熒光壽命（圖2A）。與熒光光譜一樣，熒光壽命也是熒光物質(zhì)的一種內(nèi)在特有性質(zhì)。

FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，熒光壽命成像）：是一種基于熒光壽命的顯微成像技術(shù)，其成像結(jié)果提供像素位點(diǎn)的壽命信息（如圖2B），使得我們在熒光強(qiáng)度成像之外，能更加深入地對樣品進(jìn)行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強(qiáng)度成像的眾多優(yōu)點(diǎn)，如不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響。但會(huì)因?yàn)榉肿訕?gòu)象、分子間相互作用、分子微環(huán)境、生理狀態(tài)等條件改變而發(fā)生變化，因此熒光壽命可用于分析分子的這些變化，基于熒光壽命測量的FRET是FLIM的重要應(yīng)用之一。

圖2. A. 熒光壽命示意圖；B. FLIM：提供每個(gè)像素位點(diǎn)的熒光壽命信息（左）；基于熒光壽命信息的細(xì)胞成像結(jié)果（右）

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移）：供體熒光基團(tuán)（Donor）的發(fā)射光譜與受體熒光基團(tuán)（Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)供體被激發(fā)后，且兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離小于10nm時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給受體，使受體被激發(fā)，即發(fā)生熒光能量的非放射性轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，為FRET（如圖3），這一過程也伴隨著供體熒光壽命的縮短和受體熒光壽命的延長。

圖3. FRET原理（左）^[2]及FRET實(shí)例（右）
（右）：用FLIM-FRET測量N1E-115 細(xì)胞膜上PH結(jié)構(gòu)域的相互作用，發(fā)生FRET的細(xì)胞呈現(xiàn)較短的熒光壽命（偏綠），未發(fā)生FRET的細(xì)胞呈現(xiàn)較長的熒光壽命（偏紅）

FLIM-FRET兼具 FLIM 和 FRET 兩者的優(yōu)勢，不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響，且樣品制備簡單，測量結(jié)果準(zhǔn)確性高，易重復(fù)。因此，F(xiàn)LIM-FRET非常適合于進(jìn)行分子間相互作用、分子構(gòu)象或生理狀態(tài)改變等的研究。 那么科學(xué)家是如何將FLIM-FRET應(yīng)用于監(jiān)測HIV病毒侵入宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程呢，讓我們看以下兩個(gè)實(shí)例：
（一）利用FRET生物傳感器示蹤HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞過程^[3]來自牛津大學(xué)的研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)HIV-Chameleon生物傳感器，由一對能夠發(fā)生FRET的熒光團(tuán)（mTFP1和eYFP）組成，兩個(gè)熒光團(tuán)之間通過短肽序列（包含煙草蝕刻病毒TEV蛋白酶切割位點(diǎn)）鏈接在一起（如圖4A右）。TEV蛋白酶（TEVp）可以與HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合，摻入病毒顆粒中。當(dāng)包含TEV蛋白酶的病毒與表達(dá)生物傳感器的細(xì)胞融合時(shí)，Vpr-TEV或Gag-TEV（rTEV）被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并特異性地裂解鏈接序列，增加mTFP1與eYFP之間距離至10nm以上，阻斷FRET，并可通過FLIM進(jìn)行測量。圖4B為FLIM偽彩圖與圖像中所有像素的壽命直方圖，其中藍(lán)色表示較短的壽命（無融合），紅色表示較長的壽命（融合）。這樣就可以實(shí)時(shí)定量熒光壽命的改變，從而示蹤病毒與宿主細(xì)胞融合的瞬間動(dòng)態(tài)過程。作者將所得結(jié)果與廣泛使用的BlaM分析結(jié)果比對，二者具有高度匹配性，因此，HIV-Chameleon生物傳感器與FRET-FLIM的結(jié)合使用，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)活細(xì)胞或群體的病毒融合動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測。