法國(guó)IRPF-CIPF生物制劑CMC開發(fā)研究中心和瑞士藥物科學(xué)研究所的科學(xué)家，利用Maurice中CE-SDS功能，測(cè)試了26種FDA和EMA批準(zhǔn)的單克隆抗體(mAbs)和2種抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs），該文章在Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis發(fā)表：Determination of size variants by CE-SDS for approved therapeutic antibodies: Key implications of subclasses and light chain specificities, J Pharm Biomed Anal. 2020 May 30;184:113166.
 

--研究摘要--

本研究利用Maurice-nrCE-SDS（一種非還原十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳）方法測(cè)試了，在質(zhì)量控制環(huán)境中符合測(cè)試批生產(chǎn)或批放行的質(zhì)量要求的26種FDA和EMA批準(zhǔn)的單克隆抗體(mAbs)和2種抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）。本方法允許在大約40分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地獲得藥物產(chǎn)品中分子量變異體的數(shù)量，并且該方法可用于批放行、一致性、穩(wěn)定性和保質(zhì)期評(píng)價(jià)。首先，由于添加了內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，該方法在相對(duì)遷移時(shí)間和片段的相對(duì)百分比方面(平均RSD值分別為0.3%和0.2%)重復(fù)性很好。本研究測(cè)試了一組屬于不同的亞類（重鏈γ1、2、2/4和4)和輕鏈類型(κ或λ），以及在不同的細(xì)胞系(CHO、NS0和SP2/0)中產(chǎn)生的嵌合、人源化和人單克隆抗體。對(duì)于所有這些生物制藥產(chǎn)品，H2L2種類的含量介于90.9％至97.7％之間，但屬于IgG1λ亞類的兩種mAb除外（即avelumab和belimumab在70°C的樣品制備過程中出現(xiàn)部分還原）。本研究利用的Maurice-nrCE-SDS方法獲得的多種治療性抗體（涵蓋了廣泛的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)）的測(cè)試結(jié)果，顯示可以達(dá)到大于90％的完整抗體含量（H2L2）的規(guī)格。

--研究?jī)?nèi)容--

在過去30年中，藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)了80多種mAb�？紤]到目前在臨床試驗(yàn)中各個(gè)階段評(píng)估的570種抗體的數(shù)量，以及為了確保藥物的質(zhì)量和安全性，必須在藥品生命周期的各個(gè)階段，生產(chǎn)和保質(zhì)期內(nèi)評(píng)估各種藥物的變異體，例如大小，電荷和疏水性變異體。分子量變異體是潛在的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（pCQA），通常被認(rèn)為是質(zhì)量評(píng)估研究中最重要的CQA之一，因此必須為批放行和貨架期設(shè)定規(guī)格。

Maurice-nrCE-SDS方法的高精密度

檢測(cè)mAb的細(xì)碎片段對(duì)于確定制造和產(chǎn)品穩(wěn)定性一致性至關(guān)重要。本研究通過在非還原條件下應(yīng)用通用的CE-SDS方法（nrCE-SDS）對(duì)碎片物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)。片段化物種主要是天然抗體亞基：輕鏈（L，25kDa），重鏈（H，50kDa），重-輕鏈（HL，75kDa），重-重鏈（H2，100kDa）和重-重-輕（H2L，125kDa），它們與完整mAb（H2L2，150kDa）分開，并根據(jù)其相對(duì)遷移時(shí)間（RMT）進(jìn)行鑒定。

首先利用Maurice-nrCE-SDS方法檢測(cè)和解析常見mAb分子trastuzumab單抗的能力，并在同一天使用單個(gè)樣品制備和三個(gè)重復(fù)進(jìn)樣評(píng)估了重復(fù)性。結(jié)果表明，該方法具有極高的精密度，相對(duì)片段百分比的平均RSD為9.6％，RMT的平均RSD為1.1％，在使用IS的支持下降至0.3％。

Maurice-nrCE-SDS測(cè)試原研藥和生物仿制藥的生物相似性

利用Maurice-nrCE-SDS方法，分析三種chIgG1 infliximab單抗產(chǎn)品：原研藥Remicade(圖a)和兩種EU生物仿制藥Remsina(圖b)和Inflectra（圖c）的電泳圖。結(jié)果顯示，每個(gè)峰的RMT的顯著平均RSD為0.4%，片段相對(duì)百分比的平均RSD為2.2%（Remicade）、5.5%(RemSina)和2.3%(Inflectra)，且這三個(gè)mAb的H2L2含量在92.1％到95.7％之間，總體而言，生物仿制藥電泳圖在很大程度上顯示出相似的碎片模式（其中H2L代表主要的碎片亞基）。并且所有樣品除主峰以外的所有相對(duì)峰面積的總和始終低于8％，這表明在nrCE-SDS條件下生物相似性評(píng)估的在接受的標(biāo)準(zhǔn)。

Maurice-nrCE-SDS測(cè)試IgG1亞類（輕鏈κ和λ）

此圖顯示針對(duì)Maurice-nrCE-SDS方法測(cè)試的兩種huIgG1κ（adalimumab和ofatumumab）和兩種huIgG1λ（avelumab和belimumab）的電泳圖譜。結(jié)果顯示，huIgG1κ中H2L2的相對(duì)含量等于95.9％（ofatumumab）和96.2％（adalimumab），而huIgG1λ則顯著降低，分別為75.7％和69.4%（belimumab和avelumab）。huIgG1κ產(chǎn)物的主要片段為H2L（相對(duì)量在2.2％至2.6％之間），而所有其他片段的含量都低得多（0.1％至1.1％之間）。huIgG1λ產(chǎn)品呈現(xiàn)了一個(gè)片段化模式：主要亞基由H2L（>13％），H2（>5％）和L（>2％）表示，而其他亞基與HL和H片段的總體趨勢(shì)一致（HL的0.2％至0.4％，H的0.6％）。其原因在于IgG1末端絲氨酸的存在對(duì)鏈間L-H結(jié)合的穩(wěn)定性有重大影響，使該鍵弱于鏈間H-H結(jié)合的二硫鍵。所以H2L、H2和L碎片的相對(duì)百分比特別高可能被解釋為H-L結(jié)合的脆性而導(dǎo)致斷裂。因此在分析huIgG1的應(yīng)用時(shí)，樣品制備步驟（70°C中出現(xiàn)部分還原））可能需要進(jìn)一步優(yōu)化。

Maurice-nrCE-SDS測(cè)試IgG2亞類

此圖顯示針對(duì)Maurice-nrCE-SDS方法測(cè)試的兩種人源化IgG2κ（panitumumab和denosumab）和一種人源化IgG2/4κ（eculizumab）的電泳圖。同樣，該通用方法在不到40分鐘的時(shí)間內(nèi)可以直接評(píng)估H2L2及其片段的量。結(jié)果顯示這三種mAb的H2L2含量在94.6％至96.9％之間。其主要碎片是H2L，質(zhì)量約為125kDa（相對(duì)量在2.6％和4.6％之間）。其它片段的含量要低得多（僅在0％至0.5％之間）。其中觀察到panitumumab的H2L2峰被分離為雙峰，Denosumab雖然在H2L2峰上沒有觀察到一個(gè)雙峰，但該峰相當(dāng)大，而eculizumab僅觀察到一個(gè)H2L2物質(zhì)的單峰。原因在于IgG2與IgG1和IgG4不同，其在連接兩個(gè)重鏈的鉸鏈區(qū)含有四個(gè)二硫鍵橋，因此容易產(chǎn)生二硫鍵相關(guān)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。如果需要進(jìn)一步分析，需要繼續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

Maurice-nrCE-SDS測(cè)試鉸鏈穩(wěn)定型的IgG4亞類

Maurice-nrCE-SDS方法測(cè)試了包括兩種野生型HzIgG4k（natalizumab和reslizumab）和三種鉸鏈穩(wěn)定的hzIgG4k（ixekizumab和pembrolizumab）和huIgG4k（nivolumab）生物制藥產(chǎn)品。結(jié)果顯示H2L2種類的數(shù)量在93.7％至96.3％之間變化。與其他IgG亞類相似，在這五種產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的主要片段是H2L，質(zhì)量約為125kDa（相對(duì)量在1.6％至3.9％之間），其它碎片含量極低（僅在0.1％和0.5％之間）。與其它治療性mAb相比，主要差異與％HL有關(guān)。其中野生型IgG4分別為natalizumab和reslizumab的HL%異常高，分別等于2.2％和3.9％。其原因在于野生型的IgG4：(I)鉸鏈區(qū)相關(guān)的靈活性，(Ii)鉸鏈區(qū)中兩個(gè)重鏈之間相對(duì)不穩(wěn)定的二硫鍵，(Iii)兩個(gè)重鏈的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間的非共價(jià)相互作用，從而促進(jìn)了兩個(gè)IgG4s之間的h-l對(duì)交換。盡管如此，Maurice-nrCE-SDS方法仍然輕松評(píng)估IgG4亞類產(chǎn)品中分子量變異體的數(shù)量，并且只需對(duì)電泳圖進(jìn)行目視檢查即可快速評(píng)估野生型和鉸鏈穩(wěn)定IgG4之間的差異。

Maurice-nrCE-SDS測(cè)試ADC藥物

Maurice-nrCE-SDS方法檢測(cè)了兩種第二代ADC的適用性，即鉸鏈半胱氨酸共軛Brentuximab vedotin和賴氨酸共軛Trastuzumab emtansine。ADC藥物的特征是具有一定的藥物負(fù)荷分布(DLD)、藥物與抗體比(DAR)和僅由鏈間靜電相互作用維持的H2L2結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示ADC藥物brentuximab vedotin中的8.1％的H2L2與通過HIC或native-MS評(píng)估的裸抗體量一致。L（+1接頭有效載荷，PL），H（+3LP），HL（+2LP），H2（+2LP），H2L（+1LP）和H2L2可以通過基線分辨率分離。NrCE-SDS雖然不是分析半胱氨酸連接的ADC DLD和DAR的首選方法，但可以用作鑒定方法和批次的一致性。Trastuzumab emtansine是一種賴氨酸偶聯(lián)的ADC，在賴氨酸共軛的情況下，這些ADC的H2L2結(jié)構(gòu)通過鏈間二硫鍵得以維持。因此，nrCE-SDS可以確定和分離單體和碎片，如圖所示，所有的L，H，HL，H2，H2L和H2L2均已很好地分開，且H2L2天然單體形式約占96％，與trastuzumab母體裸抗一致。

Maurice-nrCE-SDS應(yīng)用于藥物生產(chǎn)工藝

Maurice-nrCE-SDS方法檢測(cè)了在兩種不同培養(yǎng)條件下，在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的兩個(gè)不同批次的相同抗體（HzIgG1k）的nrCE-SDS結(jié)果以及質(zhì)譜鑒定結(jié)果。揭示了在大規(guī)模單克隆抗體生產(chǎn)過程中，需要優(yōu)化上游和下游的生產(chǎn)工藝才能解決由于二硫鍵的部分還原而引起的抗體片段化。而nrCE-SDS與質(zhì)譜聯(lián)用是需要在整個(gè)藥品開發(fā)階段使用。

附表（Maurice-nrCE-SDS方法測(cè)試26種單克隆抗體（mAbs）和2種抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）結(jié)果）

結(jié)論：

本研究利用Maurice-nrCE-SDS方法建立了一種通用的nrCE-SDS方法，用于確定具有不同亞型和輕鏈特異性的多種治療性抗體的分子量變異體（H2L2和LMW）的適用性。就相對(duì)遷移時(shí)間和片段與完整mAb的相對(duì)百分比而言，Maurice-nrCE-SDS方法重復(fù)性極佳。且該方法已成功應(yīng)用于IgG1，IgG2和IgG4亞類和ADC藥物。因此此方法可用于QA/QC環(huán)境下生物制藥產(chǎn)品的放行、穩(wěn)定性、批次一致性和保質(zhì)期評(píng)價(jià)。