PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，就是一種將特定的DNA片段放大擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù), 可以將微量DNA片段擴(kuò)增成便于檢測(cè)的海量目的基因片段，可將PCR看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。

最傳統(tǒng)的“代PCR”采用瓊脂糖電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但該方法操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)大。為了避免上述缺陷，同時(shí)滿足對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，1992年誕生了 “第二代PCR”——實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

▲瓊脂糖電泳儀及實(shí)驗(yàn)圖片

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)收集，而在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，最終才可確定目的基因的拷貝數(shù)或基因的表達(dá)水平。這種方法檢測(cè)靈敏度不夠，無(wú)法做到絕對(duì)定量，此時(shí)“第三代PCR”，數(shù)字PCR應(yīng)運(yùn)而生。

▲隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)

數(shù)字PCR是將一個(gè)DNA樣品分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，這些反應(yīng)單元稱(chēng)為微滴，每個(gè)微滴中都會(huì)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。最終能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，從而對(duì)起始DNA樣品絕對(duì)定量。

該方法在統(tǒng)計(jì)分析時(shí),不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本,可直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù),使得檢測(cè)靈敏度,精確性大大提高。因而在極微量DNA樣本檢測(cè)、復(fù)雜成分中微量檢測(cè)、稀有突變檢測(cè)等需要高精度定量分析領(lǐng)域具有優(yōu)勢(shì)。

▲數(shù)字PCR流程大致分為：樣品制備、目標(biāo)基因分配、RCR擴(kuò)增、結(jié)果讀出

近幾年生命科學(xué)行業(yè)的發(fā)展大家有目共睹，數(shù)字PCR檢測(cè)也得到了更廣泛的應(yīng)用，未來(lái)其在臨床也將擁有更大的應(yīng)用前景。目前已在極微量核酸樣本檢測(cè)、基因表達(dá)研究、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、腫瘤個(gè)體化診療、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查、轉(zhuǎn)基因成分鑒定等諸多方面具有廣闊應(yīng)用。

數(shù)字PCR對(duì)熒光信號(hào)分析的原理，主要開(kāi)始前在反應(yīng)體系中額外加入了特別的熒光物質(zhì)，使得每輪擴(kuò)增后特定DNA的實(shí)際數(shù)量都能夠通過(guò)熒光的強(qiáng)度變化被檢測(cè)出來(lái)。熒光的有無(wú)可以“實(shí)時(shí)”地反映樣品中是否含有特定DNA；而熒光強(qiáng)度的變化情況則可以幫助對(duì)樣品中的特定基因進(jìn)行“定量”。

目標(biāo)DNA片段本身是十分微小的，即便是通過(guò)大量擴(kuò)增，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)依然是十分微弱的，需要通過(guò)特別的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。而針對(duì)這種弱光檢測(cè)，數(shù)字PCR儀所配置的相機(jī)具有高靈敏度、高信噪比、高效率以及好的DSNU、PRNU，成為了決定檢測(cè)結(jié)果可靠性的核心因素。

超高速大視野的新一代制冷背照式sCMOS相機(jī)Kinetix，幀速可達(dá)400fps，大靶面10MP/6.5μm，效率高達(dá)95%，三種讀出模式：HDR、常規(guī)、高速。

▲超高速大視野背照式sCMOS相機(jī)—Kinetix

制冷型高靈敏 sCMOS相機(jī)pco.edge 26，可提供極低的讀出噪聲和暗電流，大靶面26MP/2.5μm，緊湊的外形設(shè)計(jì)，效率可達(dá)72 %。

▲制冷型高靈敏 sCMOS相機(jī)——pco.edge 26

非制冷大靶面sCMOS相機(jī)pco.panda 26，超高分辨率5120 x 5120，像元尺寸2.5μm，擁有真正電荷級(jí)的全局快門(mén)，極低的讀出噪聲和暗電流，超緊湊的體積，效率可達(dá)65 %。

▲非制冷大靶面sCMOS相機(jī)——pco.panda 26

緊湊型非制冷sCMOS相機(jī)pco.panda4.2系列，前照式、背照式可選， 2048×2048分辨率，像元尺寸6.5μm，幀速40fps，超緊湊的外形設(shè)計(jì)65×65×65mm，適合短時(shí)間曝光的低照度應(yīng)用，前照式80%QE、2.1e-讀出噪聲；背照式95%QE、1.8e-讀出噪聲。

▲緊湊型非制冷sCMOS相機(jī)——pco.panda4.2系列

pco.panda 26及pco.panda4.2系列均為非制冷相機(jī)，不僅擁有極高性?xún)r(jià)比，更是擁有高穩(wěn)定性、功耗低發(fā)熱量小因此暗場(chǎng)噪聲較低，無(wú)風(fēng)扇沒(méi)有抖動(dòng)確保成像品質(zhì)高，體積緊湊易于集成到PCR系統(tǒng)中。

凌云作為T(mén)ELEDYNE PHOTOMETRICS公司和PCO公司在OEM業(yè)務(wù)方向的獨(dú)家合作伙伴，可為各位視友提供的產(chǎn)品及解決方案，勵(lì)志為中國(guó)生命科學(xué)行業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)一份力量。