熒光，在生物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域是一種很常見的工具，在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用方便且用途廣泛，無論是定性還是定量，計(jì)數(shù)還是成像，熒光相關(guān)實(shí)驗(yàn)都能滿足需求。一臺操作便捷、清晰跟手的熒光顯微鏡往往比高端儀器贏得的Respect更多。熒光可以為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做些什么？它的工作原理又是什么？一起來看！

一、什么是熒光
熒光是激發(fā)態(tài)分子不通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換方式消耗能量回到基態(tài)，而是釋放出相應(yīng)較低能量的光量子。

熒光物質(zhì)都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。不同熒光物質(zhì)有其最敏感而有效的激發(fā)波長，因而選擇合適的激發(fā)/發(fā)射光譜以獲得最佳的結(jié)果，是實(shí)驗(yàn)中首要考慮的問題。在研究中常見的熒光相關(guān)參數(shù)都是相對應(yīng)的，比如AO-DNA(500/526)、AO-RNA(460/650)、PI(535/615)、DAPI(359/461)、FITC(493/517)以及GFP(498/516)等。
 

二、熒光在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

• 熒光染色計(jì)數(shù)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，熒光的應(yīng)用頻率可以說是最高的，只要涉及有關(guān)量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，就需要細(xì)胞計(jì)數(shù)。常規(guī)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)法，推薦使用臺盼藍(lán)染色。但在培養(yǎng)原代細(xì)胞或分離PBMC時(shí)，殘留的RBC被臺盼藍(lán)拒染，無核細(xì)胞的干擾會影響整體的結(jié)果判定。而AO/PI染色計(jì)數(shù)便能解決這一問題！

AO具有膜通透性，可以通過完整細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色，同時(shí)在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的凋亡小體，AO使其染上黃綠色熒光，壞死的細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失，呈現(xiàn)細(xì)胞核碎裂點(diǎn)狀大小不一、質(zhì)密濃染。

PI無膜通透性，只能通過不完整的細(xì)胞膜，因此只能使所有死細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光。

AO/PI特異性染色可以準(zhǔn)確區(qū)分死活細(xì)胞，此外實(shí)驗(yàn)室常用DAPI進(jìn)行染核。DAPI是一種能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，結(jié)合到雙鏈DNA上的熒光強(qiáng)度提高約20倍。在實(shí)驗(yàn)過程中，固定細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，再加上DAPI的強(qiáng)結(jié)合性，便可高敏感性顯示出基因表達(dá)的亞細(xì)胞情況，進(jìn)行基因定位。

• 熒光蛋白

常見有綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）。

使用最多的就是GFP，通過基因工程將其轉(zhuǎn)入基因組持續(xù)表達(dá)。最早在北冰洋寒冰水域，維多利亞多管水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了GFP，后有三位科學(xué)家分別將其投入試驗(yàn)研究，并進(jìn)行熒光的加強(qiáng)改造，最終獲得了2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

廣泛應(yīng)用后，GFP在顯像技術(shù)、示蹤技術(shù)、報(bào)告基因等應(yīng)用中大放異彩。由于其獨(dú)特的光信號轉(zhuǎn)到機(jī)制，研究者將具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子識別點(diǎn)，結(jié)合到熒光蛋白分子上設(shè)計(jì)生物感受器。可檢測核酸、激素等多種分子的表達(dá)狀況，甚至還能檢測活體細(xì)胞中蛋白的構(gòu)象變化，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

三、C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀熒光功能
實(shí)驗(yàn)室在做真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，一般都會將GFP連入質(zhì)粒，通過熒光的表達(dá)，再通過DAPI定位細(xì)胞核檢測轉(zhuǎn)染的效率。

效率又是如何計(jì)算的呢？粗略估算？手動(dòng)計(jì)數(shù)？用流式細(xì)胞儀？費(fèi)時(shí)費(fèi)力不說，約儀器還麻煩。瑞沃德新款自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀C100熒光功能可快速準(zhǔn)確計(jì)算結(jié)果細(xì)胞數(shù)量，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
 

熒光展示圖

C100具有明場計(jì)數(shù)功能，如直接計(jì)數(shù)、臺盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)等，參數(shù)調(diào)整靈活且結(jié)果清晰準(zhǔn)確。

更重要的是，機(jī)身內(nèi)配置雙通道熒光柱！（紅綠，紅藍(lán)，綠藍(lán)）可疊加兩種熒光結(jié)果，完成復(fù)雜的細(xì)胞樣品分析，AO/PI染色，一鍵計(jì)數(shù)便知結(jié)果。可快速保存細(xì)胞樣品的全部數(shù)據(jù)和圖像！時(shí)間再緊也不怕！

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