應(yīng)用專(zhuān)家 易海英
  熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光照射下，幾乎同時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)更長(zhǎng)光的過(guò)程(圖1)。當(dāng)特定波長(zhǎng)(激發(fā)波長(zhǎng))的光照射一個(gè)分子(如熒光團(tuán)中的分子)時(shí)，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級(jí)，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10^-9–10^-8秒，在此過(guò)程中電子損失一些能量②。電子離開(kāi)激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過(guò)程中③，會(huì)釋放出激發(fā)過(guò)程中吸收的剩余能量。

熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時(shí)間為熒光壽命，一般為納秒級(jí)別，是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM)，可以在熒光強(qiáng)度成像之外，更加深入地進(jìn)行功能性精準(zhǔn)測(cè)量，獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。
熒光的另一個(gè)重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長(zhǎng)差異（圖2）。通常發(fā)射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前，電子經(jīng)過(guò)弛豫過(guò)程會(huì)損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過(guò)程的追蹤等等。
細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光，想要觀察它們，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多，可以直接標(biāo)記（比如使用DAPI標(biāo)記DNA），或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色，也可以用熒光蛋白（如GFP，綠色熒光蛋白）標(biāo)記目標(biāo)蛋白，還可以用可逆結(jié)合的合成染料（如Fura-2）等。 目前熒光顯微鏡已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室及成像平臺(tái)的標(biāo)配成像設(shè)備，是我們?nèi)粘��?shí)驗(yàn)的好幫手。熒光顯微鏡主要分為三大類(lèi)：正置熒光顯微鏡（適合切片）、倒置熒光顯微鏡（適合活細(xì)胞，兼顧切片）、熒光體視鏡（適合較大標(biāo)本，如植物、斑馬魚(yú)（成體/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。
熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件，由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成，安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里，如Leica DMi8配有6位濾片轉(zhuǎn)輪（圖3）。不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會(huì)有區(qū)別，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。
濾塊在熒光成像中起著重要作用：激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來(lái)激發(fā)樣品，阻擋其他波長(zhǎng)的光；通過(guò)激發(fā)濾片的光經(jīng)過(guò)二向分光鏡（其作用是反射激發(fā)光和透射熒光），反射后通過(guò)物鏡聚焦，照射到樣品，激發(fā)出對(duì)應(yīng)的熒光即發(fā)射光，發(fā)射光被物鏡收集，透過(guò)二向分光鏡，到達(dá)發(fā)射濾片。如圖4中：激發(fā)波長(zhǎng)為450-490nm，二向分光鏡反射短于510nm的光、透過(guò)長(zhǎng)于510nm的光，發(fā)射光接收范圍為520-560nm。 熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長(zhǎng)通（long pass，簡(jiǎn)稱(chēng)LP）和帶通（band pass，簡(jiǎn)稱(chēng)BP）兩種類(lèi)型。帶通通常由中心波長(zhǎng)和區(qū)間寬度確定，如480/40表示可通過(guò)460-500nm的光。長(zhǎng)通濾色片如515 LP，表示可以通過(guò)波長(zhǎng)長(zhǎng)于515nm的光（圖5）。
熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)（吸收）曲線和發(fā)射曲線，激發(fā)峰為最佳激發(fā)波長(zhǎng)（激發(fā)效率最高，從而可以降低激發(fā)光能量，保護(hù)細(xì)胞和染料），發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長(zhǎng)范圍。因此，在實(shí)驗(yàn)中，我們會(huì)盡可能選擇與激發(fā)峰最接近的波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，而接收范圍需包括發(fā)射峰。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm，在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片。
濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到最匹配樣品的濾塊對(duì)于熒光成像有著至關(guān)重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說(shuō)明書(shū)中會(huì)注明，也可在網(wǎng)上查閱（如https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/、https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-proteins-introduction-and-photo-spectral-characteristics/）。
濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源，目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)�，以及近年�?lái)飛速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的，在不同波段能量也會(huì)不同。LED光源因?yàn)槠湎鄬?duì)較窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長(zhǎng)的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)，正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。
除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊，還有外置快速轉(zhuǎn)輪（圖7），徠卡的外置快速轉(zhuǎn)輪相鄰位置濾片轉(zhuǎn)換速度為27ms，可實(shí)現(xiàn)高速多色實(shí)驗(yàn)，如FRET及Fura2比例鈣成像（圖8）等。