熒光顯微成像技術(shù)對(duì)生命科學(xué)的研究起到了巨大的推進(jìn)作用，但自發(fā)熒光信號(hào)往往會(huì)對(duì)成像結(jié)果造成非常大的干擾（圖1）。常規(guī)的解決方法主要是通過(guò)改進(jìn)制樣流程和調(diào)節(jié)成像參數(shù)來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，但這些方法只能起到部分的改善作用，并不能徹底去除自發(fā)熒光信號(hào)。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)路上的絆腳石難道真的就沒(méi)有辦法了嗎？當(dāng)然不是，接下來(lái)就為您介紹自發(fā)熒光的克星——熒光壽命。
熒光分子受到特定激光激發(fā)后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光并回到基態(tài)，熒光分子停留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間就叫做熒光壽命（圖2）。如果自發(fā)熒光和我們用來(lái)標(biāo)記樣本的熒光基團(tuán)的壽命存在較大的差異，通過(guò)調(diào)節(jié)熒光壽命檢測(cè)范圍，就可以避免這些干擾信號(hào)的接收了。
圖2.熒光激發(fā)示意圖

從激發(fā)光開(kāi)始照射樣品到檢測(cè)器探測(cè)到光子的這段時(shí)間稱(chēng)作“光子到達(dá)時(shí)間”。樣品的“熒光壽命”與“光子到達(dá)時(shí)間”呈正相關(guān)，而一個(gè)像素點(diǎn)中包含多個(gè)光子，多個(gè)光子到達(dá)時(shí)間的平均值（Average Arrival Time, AAT）就可以反映該像素點(diǎn)的熒光壽命信息。
徠卡全新推出的帶有白激光的STELLARIS系列激光共聚焦顯微鏡（圖3）配備了基于AAT檢測(cè)技術(shù)的TauSense模塊，它包含三大項(xiàng)功能，對(duì)您的實(shí)驗(yàn)大有裨益，大家一起來(lái)認(rèn)識(shí)一下吧！

圖3. STELLARIS

• TauGating

獲得高質(zhì)量的熒光圖像是成像實(shí)驗(yàn)最基本的需求，但背景噪音、自發(fā)熒光、反射光、雜散光等等頑固分子一次次地挑戰(zhàn)著我們的耐心，而使用TauGating即可一鍵式去除這些干擾因素。
TauGating操作非常簡(jiǎn)單，如圖4，點(diǎn)擊“+”或“-”即可靈活修改通道數(shù)，可設(shè)置多達(dá)16個(gè)通道，每個(gè)通道的時(shí)間檢測(cè)范圍均可獨(dú)立調(diào)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，上述干擾因素的AAT和熒光信號(hào)的AAT存在差異，通過(guò)調(diào)節(jié)時(shí)間檢測(cè)范圍即可避開(kāi)對(duì)干擾因素的接收，獲得真實(shí)的熒光信號(hào)。
圖4. TauGating操作界面
從圖5可以看到，和常規(guī)共聚焦成像相比，TauGating消除了背景雜散光，圖像的對(duì)比度和信噪比得到了極大的提升。

圖5. TauGating與常規(guī)共聚焦成像效果對(duì)比

• TauSeparation

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，熒光基團(tuán)的選擇是一件非常重要且復(fù)雜的事情，不僅要考慮到各種繁雜的光譜組合來(lái)避免通道之間的串色，還要考慮使用和共聚焦固定激發(fā)譜線相匹配的染料。如此一來(lái)，留給我們的選擇往往就會(huì)很少，如果樣本中有自發(fā)熒光，染料選擇就更加受限了。針對(duì)這項(xiàng)問(wèn)題，TauSeparation可以為您提供絕佳的解決方案。

圖6. NE-115細(xì)胞4色熒光成像 圖6中，NE-115細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記了LifeAct-mNeonGreen、Mitotracker Green、 NuC Red 和 SiR-tubulin共4種熒光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和 Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊，NuC Red和 SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊，所以在用常規(guī)共聚焦（左圖）拍攝時(shí)只能體現(xiàn)出兩種信號(hào)的差異。而在TauSeparation模式下（右圖），通過(guò)檢測(cè)AAT，我們使用一個(gè)檢測(cè)器就可以同時(shí)將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來(lái)（LifeAct-mNeonGreen-紅色，Mitotracker Green-綠色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品紅色），所以只需要使用兩個(gè)檢測(cè)器，就可以得到這幅沒(méi)有串色的4色熒光圖像了。

圖7. 植物組織自發(fā)熒光檢測(cè)
自發(fā)熒光拆分
對(duì)于自發(fā)熒光的拆分，TauSeparation同樣得心應(yīng)手。例如圖7左側(cè)的常規(guī)熒光強(qiáng)度圖像，熒光信號(hào)和背景自發(fā)熒光沒(méi)有區(qū)別；右側(cè)的圖像在TauSeparation模式下，葉綠體中的自發(fā)熒光（藍(lán)色）與來(lái)自細(xì)胞膜的目標(biāo)熒光信號(hào)（綠色）就可以非常清楚地區(qū)分開(kāi)了，是不是很簡(jiǎn)便呢？

• TauContrast

當(dāng)您選擇在TauContrast模式下成像時(shí)，不但可以獲取常規(guī)的熒光強(qiáng)度圖像，還可以通過(guò)AAT獲取分子的代謝狀態(tài)、pH值和離子濃度等功能信息，充分挖掘出樣本潛在信息。例如圖8中Ca²⁺濃度會(huì)影響熒光基團(tuán)Oregon Green 的熒光壽命，通過(guò)TauContrast可以實(shí)時(shí)獲取Oregon Green的AAT，從而反映各框選區(qū)域（ROI）的Ca²⁺濃度隨時(shí)間的變化水平。

圖8. 機(jī)械刺激后對(duì)標(biāo)記了Oregon Green 488的哺乳動(dòng)物細(xì)胞鈣振蕩進(jìn)行檢測(cè)。在TauContrast模式下通過(guò)檢測(cè)AAT的變化來(lái)記錄單個(gè)細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)情況。以4.5fps的拍攝速率記錄了AAT在不同框選區(qū)域的變化軌跡（用不同顏色選擇的ROI）。圖像尺寸：256 × 256 pixels；Rainbow LUT (TauContrast): 0-4 ns.   
沒(méi)有自發(fā)熒光的干擾，全流程的選擇自由，讓您可以任意pick熒光染料和熒光蛋白，讓您的idea不再受到硬件設(shè)施的限制。STELLARIS能給您帶來(lái)的好處遠(yuǎn)不止于此，歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號(hào)，我們將持續(xù)為您帶來(lái)更多更詳盡的的講解�？蒲新仿�漫，愿STELLARIS助您的科研之舟乘風(fēng)破浪，揚(yáng)帆遠(yuǎn)航！