樣本制備是任何實(shí)驗(yàn)中都必不可少的關(guān)鍵性步驟，在核酸提取實(shí)驗(yàn)中，有些樣本的裂解極為困難，這時(shí)候如果利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行破碎，不僅樣本處理的效果差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力甚至還會(huì)遇到交叉污染的情況，最終結(jié)果也頗受影響。

就實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化而言，儀器的使用將會(huì)降低時(shí)間，提升效率，裂解介質(zhì)管的使用則可以避免實(shí)驗(yàn)過程中的交叉污染。MP Biomedicals可以提供一整條包括從樣本準(zhǔn)備到樣本裂解及核酸、蛋白純化完整解決方案的綜合產(chǎn)品線。

FastPrep-24^TM 5G是FastPrep家族中的明星產(chǎn)品，年初的時(shí)候還被選入巴西南極科考站，制備儀用裂解珠碰撞法（beads-beating）能夠處理各種類型樣本，獨(dú)有的“橫8字”運(yùn)動(dòng)可產(chǎn)生3向剪切力，可在短短40s內(nèi)，充分裂解難處理樣本。包括復(fù)雜麻煩的植物樣本和極端氣候下的艱難樣本。

下面讓小編帶大家詳細(xì)了解下FastPrep-24^TM 5G在環(huán)境微生物、人體皮膚組織，動(dòng)物組織中的應(yīng)用吧~

01.研究完整的病毒分離

•研究目的：從受感染的動(dòng)物組織中分離出完整的病毒（例H5N1病毒）^[1]

•應(yīng)用：病毒滴定

•樣品名稱：小鼠肺組織

•材料：FastPrep-24™ 5G，2 mL裂解介質(zhì)管M（含1/4英寸陶瓷珠）

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將小鼠肺組織（100-150mg）置于裂解介質(zhì)管M中，快速冷凍，并在-70℃下保存。

2.向裂解介質(zhì)管M中加入1 mL預(yù)冷的緩沖液。

3.用FastPrep儀器以4.0 m/s的速度將組織均質(zhì)化20秒。

4.將試管置于冰上孵育2分鐘。

5.重復(fù)步驟3。

6.向裂解介質(zhì)管中加入0.5mL培養(yǎng)基，10000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘后，取上清進(jìn)行后續(xù)的病毒滴度實(shí)驗(yàn)。

結(jié)論：Fastprep儀器配合裂解介質(zhì)M使用，可從被感染的組織中，成功分離完整的病毒顆粒。

 

02.研究濾膜中的微生物

•研究目的：飛機(jī)空氣中細(xì)菌多樣性研究^[2]

•應(yīng)用：有助于傳染性生物傳感器的設(shè)計(jì)

•樣品名稱：61架飛機(jī)高效微粒空氣（HEPA）過濾器

•材料：FastPrep-24™ 5G，裂解介質(zhì)管E

 

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將一塊4 cm²（2 cm x 2 cm）的HEPA過濾器切成小塊，并放入裂解介質(zhì)管E中。

2.添加緩沖液后，在FastPrep儀器中以5.5 m/s的速度運(yùn)行35秒。

3.針對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行二代測(cè)序，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析從而得到樣本中細(xì)菌的組成比例與多樣性信息。
 

結(jié)論：與43個(gè)城市周圍室外空氣樣本比較，飛機(jī)空氣中的細(xì)菌群落組成有所不同，飛機(jī)空氣中的厚壁菌門（Firmicutes）和γ-變形桿（Gammaproteobacteria）的相對(duì)豐度較高，而室外空氣樣本中的放線菌（Actinobacteria）和β-變形菌（Betaproteobacteria）的相對(duì)豐度較高。此外，飛機(jī)和室外空氣樣本含有人類病原體的分類群也有所不同。這些結(jié)果表明HEPA過濾器樣品可用于深入分析飛機(jī)空氣中的細(xì)菌多樣性，并表明在飛機(jī)生物傳感器的探針設(shè)計(jì)中必須考慮到某些病原體的存在。

環(huán)境樣本（土壤、水體、空氣等）中，微生物種類繁多，組分也相對(duì)復(fù)雜。對(duì)于環(huán)境樣本可選擇使用裂解介質(zhì)管E配合FastPrep儀器進(jìn)行處理。裂解介質(zhì) E 含有1.4 mm陶瓷珠，0.1 mm硅珠和一個(gè)4 mm玻璃珠，用于有效破碎環(huán)境樣本中的有機(jī)物，如：真菌，孢子和內(nèi)生孢子，革蘭氏陽(yáng)性菌，酵母菌，藻類，線蟲和真菌。

 

03.研究皮膚活檢樣本

•研究目的：優(yōu)化皮膚組織中RNA和蛋白質(zhì)的提取^[3]

•應(yīng)用:Western blot和RNA質(zhì)量分析

•樣品名稱：人體皮膚組織活檢

•材料：FastPrep-24™ 5G，裂解介質(zhì)管D

 

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將19 mg的皮膚樣品添加到裂解介質(zhì)管D中。

2.加入1 mL異硫氰酸胍緩沖液（5.1 M異硫氰酸胍，50 mM檸檬酸鈉，50 mM EDTA，0.5％β-巰基乙醇）。

3.在FastPrep儀器中以6.0 m/s的速度勻漿40秒，循環(huán)3次，每次循環(huán)之間需將裂解介質(zhì)管放在冰上預(yù)冷5分鐘。

4.以14,000 x g離心5-10分鐘，去除沉淀，取上清。

5.繼續(xù)RNA和蛋白質(zhì)的提取步驟。

備注：使用Nanodrop對(duì)RNA進(jìn)行定量，并使用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

結(jié)論：雖然比較容易獲取皮膚組織，但是由于其天然的抗機(jī)械剪切能力和含有大量的RNA酶和蛋白酶，導(dǎo)致很難被處理。而這些難題能夠?qū)е翿NA被降解，使RNA的產(chǎn)量不穩(wěn)定。使用FastPrep樣本制備儀配合裂解介質(zhì)D可從3 mm全層皮膚活檢組織中提取高質(zhì)量的RNA和蛋白，可以確保實(shí)驗(yàn)的一致性并減少樣本在外源污染物中的暴露。使用此方法可提取1-2μg RNA和150 mg蛋白，獲得的產(chǎn)物可直接運(yùn)用于多種下游應(yīng)用，包括DNA微陣列（DNA Microarray），實(shí)時(shí)定量PCR，二維凝膠電泳和Western blot分析。

 

你以為以上就是FastPrep-24^TM 5G全部的應(yīng)用方向了么？NO,NO,NO~

結(jié)語(yǔ)：樣本采集、核酸分離是實(shí)驗(yàn)中不可或缺的一步，除了FastPrep-24^TM 5G以外，F(xiàn)astPrep樣本制備家族還有各類儀器，豐富的裂解介質(zhì)管以及相宜配套的提取試劑盒，讓您的實(shí)驗(yàn)做到事半功倍。
 

相關(guān)文獻(xiàn)

[1] BodewesR. ; KreijtzJ. H. C. M. et al. Vaccination against Human Influenza A/H3N2 Virus prevents the induction of heterosubtypic immunity againstlethal infection with Avian Influenza A/H5N1 virus. PLoSONE (2009) Vol 4 : e5538

[2] Korves, T., Piceno, Y., Tom, L., DeSantis, T., Jones, B., Andersen, G. and Hwang, G., 2012. Bacterial communities in commercial aircraft high-efficiency particulate air (HEPA) filters assessed by PhyloChipanalysis.Indoor Air, 23(1), pp.50-61.

[3] Berglund S R , Schwietert C W , Jones A A , et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2007, 127(2):349-353.