分離病毒及構建假病毒在抗疫研究中的應用
新冠疫情已經在全球范圍爆發(fā)，目前確診感染人數已經超過190萬，并且這一數值還在持續(xù)增長中。在疫情爆發(fā)初期，我國科研戰(zhàn)線迅速行動，不到一周時間就確定了新冠病毒的全基因組序列并分離得到了病毒毒株，及時向全球共享。那么為什么分離病毒毒株這么重要呢？
毒株分離的意義和難度
病毒毒株的分離對于疫情的防控、抗病毒藥物的篩選、疫苗研制等都具有重要意義。首先，分離病毒毒株后，可以得到新冠病毒包括衣殼蛋白、全基因組序列在內的更詳細的信息，幫助快速診斷試劑盒的研發(fā)，這對于新冠肺炎患者的臨床診斷和治療有非常積極的幫助。其次，得到病毒毒株后，將助力于其致病機理的研究，例如新冠病毒與宿主的結合機制、感染病毒后細胞內的免疫應答等等。最后，病毒毒株的成功分離可以幫助進行抗病毒藥物的篩選和疫苗的研發(fā)。正如中國工程院李蘭娟院士所說，“分離出病毒毒株，意味著我們已經擁有了疫苗的種子株。用其制作疫苗株并通過檢測后，就可以制備疫苗”。
左圖1：新冠病毒電鏡照片（來自中國微生物組數據中心）；右圖2：新冠病毒透射顯微鏡圖像（來自NIAID-RML)假病毒及病毒載體揭秘
隨著科學家們不斷深入地了解和研究，開發(fā)表達刺突蛋白（S蛋白）的新冠假病毒成為輔助治療性篩選的有力工具。截止到目前為止已有多篇基于SARS-CoV-2假病毒中和抗體活性檢測的文章發(fā)表在國際權威雜志上。假病毒不僅可應用于血清中和抗體檢測，還為后續(xù)單克隆抗體及抗病毒藥物篩選和評價、疫苗研發(fā)及病毒感染機制研究等奠定了基礎。
圖3：由中國醫(yī)學科學院/北京協和醫(yī)學院病原生物學研究所的研究團隊在國際頂級學術期刊Nature的子刊Nature Communication上發(fā)表 ——《Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV》。此項研究構建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統(tǒng)和293T的hACE2穩(wěn)轉細胞系，以此確定SARS-CoV-2的易感細胞系、病毒受體、侵入途徑和蛋白酶激活，揭示了SARS-CoV-2入侵人體細胞的具體過程。
圖4：SARS-CoV-2-S假病毒包裝過程，圖片來源醫(yī)麥新觀察丨《新冠病毒株極難獲得，假病毒提供解決方案助力藥物開發(fā)》
假病毒是依據已公開的序列而制備成一種具有原病毒的基本特點和免疫原性，同時又不具備致病性，方便實驗室大規(guī)模使用的替代物。由于其生物安全風險較低（僅要求實驗室生物安全級別二級(BSL-2)），質控方法可控，可以長期穩(wěn)定制備和供應。假病毒因其具有“逼真” 、穩(wěn)定、安全等特點，已被廣泛用于研究感染機制，受體識別和病毒抑制，以及開發(fā)和評估抗體和疫苗。
假病毒構建通常都依賴于病毒載體系統(tǒng)的重組包裝(圖5)，理想的病毒載體同樣也表現出基因組穩(wěn)定性、細胞型特異性、有效感染率高、對受感染細胞生理機能影響小，同時致病性小等特點。借助病毒載體，例如，慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、腺病毒 (Adenovirus)、腺相關病毒(Adeno-associated Virus, AAV)將外源基因轉導入細胞并構建新的假病毒模型已被廣泛應用于生命科學研究，科學家已經探索了出多種用于創(chuàng)建包膜型假病毒的包裝系統(tǒng)，用于諸如埃博拉病毒(EBOV)，馬爾堡病毒(MARV)和拉沙熱病毒(LASV)等新興傳染病(EID)的研究。
科研人員使用假病毒模擬抗體阻斷病毒進入細胞的生物過程，檢測抗體或血清對假病毒是否具有中和活性 (假病毒通常經過改造以攜帶熒光素酶報告基因，使其進行定量分析時比對野生型病毒容易得多，而且已證明假病毒感染的細胞數量與報告基因表達成正比)。圖5：假病毒包裝過程 - 將熒光素酶和gp64基因插入VSV的全長cDNA克隆中（代替G基因命名為ΔG-Luc）。gp64pv和VSVpv是通過將VSVΔG / Luc-* G分別瞬時感染表達GP64和VSVG的293T細胞而產生的。
由于病毒與假病毒顆粒較小，直徑基本在20-300納米之間 （新冠病毒電鏡照片顯示其直徑僅為100納米），低轉速、低離心力條件并不能使病毒顆粒充分沉降，須借助超速離心技術來進行病毒顆粒分離。
而病毒載體的分離方式與病毒類似—當攜帶目的基因的病毒載體感染培養(yǎng)的細胞，受感染細胞生產新的同類病毒，并釋放進入培養(yǎng)基中，再將新病毒重新采集并純化。在此過程中產生的病毒載量、純度和質量都會直接影響后續(xù)載體的轉導效率。高效可靠的離心方案同樣有助于優(yōu)化病毒載體純化，例如：在高速和超速離心條件下，能有效地將病毒顆粒從細胞、細胞碎片中精細分離；借助分析性超速離心（AUC） 的流體動力學和熱力學全方位精準測量，則可根據病毒衣殼密度（一種病毒載量衡量方式），來真實鑒定區(qū)分完整、含部分遺傳物質、空殼病毒載體及其他細胞雜質，提高包裝效率，提供藥用級別病毒載體顆粒質控 。
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參考文獻
1. Xiuyuan Ou et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat Commun. 2020 Mar 27;11(1):1620.
2. Yuuki Kaname et al. Acquisition of Complement Resistance through Incorporation of CD55/Decay-Accelerating Factor into Viral Particles Bearing Baculovirus GP64. JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2010, p. 3210–3219 Vol. 84, No. 7
3. Qianqian Li et al. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology : Vol 28 , No 1
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