新冠病毒研究用水系列三:如何獲得完美的核酸電泳條帶
瀏覽次數(shù):3464 發(fā)布日期:2020-5-12
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在新冠病毒2019-nCoV的分子生物學(xué)研究中,電泳技術(shù)是一個重要的方法,主要用于核酸、蛋白質(zhì)的分離與鑒定,使用的實驗儀器主要是電泳儀。本文,樂楓純水為大家總結(jié)了實驗中常出現(xiàn)的問題和解決方法。
什么是核酸電泳?
核酸電泳是基因操作的核心技術(shù)之一,用于分離、鑒定DNA、RNA 分子混合物和純化DNA片段。
核酸電泳最讓大家頭疼的問題 - 異常條帶
核酸電泳實驗中,常常會遇到條帶模糊、拖尾、扭曲等現(xiàn)象,究其原因,除了操作不當,電泳條件未優(yōu)化,電泳緩沖液也是重要的影響因素之一。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。
- 緩沖液離子強度低,電導(dǎo)率小,導(dǎo)致DNA遷移緩慢;如果多次使用,離子強度降低,PH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。
- 緩沖液離子強度高,則電導(dǎo)率高并明顯產(chǎn)熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
表1 核酸電泳條帶異常原因匯總及建議的解決方法
常見問題 |
原因 |
解決方法 |
條帶模糊 |
核酸降解 |
使用不含核酸酶的超純水配置緩沖液 |
電泳緩沖液陳舊 |
建議經(jīng)常更換緩沖液 |
有蛋白污染 |
使用低有機物的超純水配置緩沖液 |
核酸變性 |
使用超純水或者緩沖液稀釋樣品 |
條帶黯淡 |
核酸濃度過低 |
增加上樣量 |
核酸降解 |
使用不含核酸酶的超純水配置緩沖液 |
條帶被示蹤染料掩蓋 |
提高上樣量;避免使用與目的片段遷移率相同的示蹤染料 |
拖帶或涂抹帶 |
PCR體系或PCR程序不合適 |
優(yōu)化PCR體系和PCR程序 |
條帶扭曲 |
配膠的緩沖液和電泳緩沖液不同 |
配膠和電泳中使用同一批緩沖液 |
電泳時電壓過高 |
控制電泳時電壓不超過6V/CM |
核酸電泳用純水要求
為了防止水中雜質(zhì)(如:核酸酶、蛋白質(zhì)、離子等)對電泳結(jié)果的影響,核酸電泳實驗配置緩沖溶液或稀釋樣品需要使用超純水:
- 電阻率 18.2 MΩ·cm
- TOC < 10 ppb
- 無核酸酶和蛋白酶
- 細菌總數(shù)< 1 CFU/mL
- 熱原< 0.005 EU/mL
- 0.22μm 或更低的顆粒過濾
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