PCR替代技術(shù)，RPA全攻略之疑難解答
 

      重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)(由英國(guó)公司TwistDx Inc開(kāi)發(fā))。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp® 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA反應(yīng)需要在怎樣的溫度下進(jìn)行?

      標(biāo)準(zhǔn)TwistAmp®試劑盒的運(yùn)行溫度在37°C - 42°C之間。溫度超過(guò)42°C會(huì)使酶的活性受到影響。RPA反應(yīng)在低于37°C的條件下也能進(jìn)行，不過(guò)TwistAmp®試劑盒已經(jīng)針對(duì)反應(yīng)速度進(jìn)行了優(yōu)化，不一定支持超出范圍的溫度條件。為了獲得更好的效果，TwistDx公司推薦用戶在40°C下使用于逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

RPA反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)多重化么?

       可以。RPA技術(shù)支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。不過(guò)，多重化的引物組合需要精心設(shè)計(jì)，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標(biāo)太多。如果在一個(gè)反應(yīng)中使用兩個(gè)以上的擴(kuò)增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測(cè)多個(gè)擴(kuò)增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。

RPA反應(yīng)需要在特殊儀器上進(jìn)行么?

      不需要。對(duì)TwistAmp®基礎(chǔ)試劑盒和nfo試劑盒而言，只要溫度能控制在37-42°C之間就行。進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的體系(如TwistAmp® exo試劑盒)，需要能夠激發(fā)和檢測(cè)熒光團(tuán)的恒溫裝置，比如酶標(biāo)儀或?qū)崟r(shí)檢測(cè)的熱循環(huán)儀。

RPA反應(yīng)能對(duì)模板進(jìn)行定量么?

      可以。擴(kuò)增子達(dá)到可檢出水平的時(shí)間，依賴于反應(yīng)起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過(guò)，這種定量需要精心的實(shí)驗(yàn)安排，確保對(duì)照反應(yīng)是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因?yàn)殒V離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會(huì)開(kāi)始。
此外，較慢的擴(kuò)增過(guò)程有助于更精確的定量。我們可以通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計(jì)來(lái)減慢RPA的反應(yīng)速度。

擴(kuò)增產(chǎn)物能在瓊脂糖凝膠上分析么?

      可以，TwistAmp®基礎(chǔ)反應(yīng)、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通過(guò)跑膠進(jìn)行終點(diǎn)分析。不過(guò)TwistAmp® exo不行，因?yàn)樵撓到y(tǒng)里的外切核酸酶會(huì)消化擴(kuò)增子。

擴(kuò)增反應(yīng)能進(jìn)行熒光終點(diǎn)分析么?

      可以。這樣比較的是反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的熒光和反應(yīng)結(jié)束時(shí)的熒光，熒光增強(qiáng)意味著發(fā)生了擴(kuò)增。

RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么?

      支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何差異。

能用插入性染料實(shí)時(shí)監(jiān)控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反應(yīng)中進(jìn)行定量和監(jiān)控。不過(guò)，這種染料可以結(jié)合任何雙鏈DNA，會(huì)生成來(lái)自引物的假陽(yáng)性信號(hào)。由于RPA擴(kuò)增在常溫下進(jìn)行，這種噪音會(huì)比PCR嚴(yán)重一些。此外，不推薦把插入性染料用于TwistAmp® exo體系，因?yàn)轶w系中的核酸外切酶會(huì)在反應(yīng)過(guò)程中切割擴(kuò)增產(chǎn)物。

RPA試劑能制成master-mix么?

      可以。在進(jìn)行DNA檢測(cè)時(shí)，可以把重懸緩沖液、引物和探針混合在一起，重懸凍干的RPA pellets。然后將不同DNA加入反應(yīng)體系，最后用MgAc起始反應(yīng)。在進(jìn)行引物篩選時(shí)，可以用重懸緩沖液、模板DNA、探針和一個(gè)引物制成master-mix，將其分裝到1.5 ml小管之后再分別加入不同的引物。注意：只有當(dāng)兩個(gè)引物都存在時(shí)，才能重懸凍干的RPA pellets，否則重組過(guò)程就會(huì)有偏向性。

跑膠之前需要回收RPA產(chǎn)物么?

      需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會(huì)干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來(lái)的帶會(huì)出現(xiàn)拖尾。

RPA反應(yīng)的擴(kuò)增子能保存么?

       TwistAmp® Basic或nfo的擴(kuò)增產(chǎn)物可以保存，短期可以放在4°C，保存時(shí)間較長(zhǎng)的話建議放在-20°C。

TwistAmp® exo (RT)的擴(kuò)增產(chǎn)物不能保存。因?yàn)閿U(kuò)增停止后如果沒(méi)有及時(shí)失活，外切酶III會(huì)快速消化擴(kuò)增子。

TwistAmp® 基礎(chǔ)反應(yīng)的擴(kuò)增子能進(jìn)行TA克隆么?

      TwistAmp®基礎(chǔ)反應(yīng)中的聚合酶沒(méi)有編輯功能，擴(kuò)增子應(yīng)該是可以用于TA克隆的。不過(guò)TwistDx公司還沒(méi)有針對(duì)這項(xiàng)應(yīng)用進(jìn)行過(guò)測(cè)試。

能直接用標(biāo)記的探針和TwistAmp®基礎(chǔ)試劑盒進(jìn)行側(cè)流層析檢測(cè)么?

      可以。你可以用兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的引物來(lái)進(jìn)行側(cè)流層析檢測(cè)(LFD)。不過(guò)TwistDx公司推薦使用探針和TwistAmp® nfo 試劑盒。這是因?yàn)镽PA跟PCR差不多，也傾向于形成引物二聚體。如果引物不完美，很容易發(fā)生交叉反應(yīng)，生成假陽(yáng)性結(jié)果。而TwistAmp® nfo體系能夠避免這個(gè)問(wèn)題。

在用側(cè)流層析試紙進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要稀釋RPA產(chǎn)物么?

      是的。RPA反應(yīng)中的一些物質(zhì)會(huì)干擾試紙上的抗體，如果不能充分稀釋就會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合和假陽(yáng)性信號(hào)。

在TwistAmp® exo (RT)反應(yīng)即將結(jié)束時(shí)熒光急劇增強(qiáng)，這正常么?

       是正常的。在TwistAmp® exo反應(yīng)中，聚合酶和核酸外切酶III處于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。隨著反應(yīng)的能量逐漸耗盡，核酸外切酶III開(kāi)始占據(jù)優(yōu)勢(shì)，結(jié)果導(dǎo)致熒光信號(hào)出現(xiàn)劇增。

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